extracellulaire matrixvoorbereiding en reologie

het ECM bestaat uit een netwerk van gelatine en fibrine. Voor de bereiding van de ECM-componenten wordt eerst een gelatineoplossing van 15 wt/v% (type a, 300 bloom from porcine skin, Sigma) geproduceerd door gelatinepoeder toe te voegen aan een warme oplossing (70 °C) DPBS (1x Dulbelco ‘ s fosfaatgebufferde zoutoplossing zonder calcium en magnesium). De gelatine wordt volledig opgelost door 12 uur bij 70 °C te roeren, waarna de pH wordt ingesteld op 7,5 met 1 M NaOH. De oplossing wordt steriel gefilterd en bewaard bij 4 °C in aliquots voor later gebruik bij het gieten (<3 maanden). Een fibrinogeenoplossing (50 mg / mL) wordt geproduceerd door het oplossen van gevriesdroogde runderbloedplasma-eiwit (Millipore) bij 37 °C in steriele DPBS zonder calcium en magnesium. De oplossing wordt gedurende ten minste 45 minuten bij 37 °C gehouden zonder te schudden om volledig op te lossen. De transglutaminase (tg) – oplossing (60 mg / mL) wordt bereid door gevriesdroogd poeder (Moo Gloo) op te lossen in DPBS zonder calcium en magnesium en gedurende 20 sec. voorzichtig te mengen.de oplossing wordt vervolgens 20 minuten bij 37 °C gehouden en steriel gefilterd alvorens te gebruiken. Een CaCl2-stamoplossing (250 mM) wordt bereid door CaCl2-poeder op te lossen in DPBS zonder calcium en magnesium (Corning). Om de stamoplossing van trombine te bereiden, wordt gevriesdroogd trombine (Sigma Aldrich) gereconstitueerd in 500 E/mL met steriele DPBS en bewaard bij -20 °C. trombine-aliquots worden onmiddellijk voor gebruik ontdooid.

een gecontroleerde spanningsreometer (DHR-3, TA Instruments, New Castle, DE) met een diameter van 40 mm, 2° kegel en plaatgeometrie wordt gebruikt voor metingen van de reologie van inkt. De shear storage (G’) en loss (G’) moduli worden gemeten bij een frequentie van 1 Hz en een oscillatoire spanning (γ) van 0,01. Tijdvegers worden uitgevoerd door snel een voorgemengde ECM-oplossing die trombine bevat op de Peltierplaat te plaatsen die bij 37 °C wordt gehouden.

Inktformuleringen

twee inkten zijn nodig voor 3D bioprinting van perfuseerbare PT-modellen. Een inkt, die wordt gebruikt om de perfusiechip pakking te maken, bestaat uit een tweedelig siliconenelastomeer (SE 1700, Dow Chemical) met een 10:1 Basis aan katalysator (gewicht) die wordt gehomogeniseerd met behulp van een centrifugale mixer gedurende 2 minuten (2000 rpm, AE-310, Thinky Corp, Japan). De siliconeninkt wordt binnen 2 uur na het mengen met de katalysator geprint. Deze inkt wordt geladen in een spuit (EFD Inc., East Providence, RI) en gecentrifugeerd om eventuele luchtbellen te verwijderen alvorens op kamertemperatuur te printen. De andere inkt, een diffuse inkt die gebruikt wordt om de tubulus te printen, bestaat uit 38 wt% Pluronic F127 (Sigma) en 100 U/mL trombine in gedeïoniseerd, ultrafiltrated (DIUF) water. De diffuse inkt wordt roze geverfd door toevoeging van een risk Reactor kleurstof voor visualisatie in Fig. 1 en film S1. Om deze inkt te bereiden, wordt een 40 wt% Pluronische f127-oplossing in water gehomogeniseerd met behulp van een Thinky mixer totdat het poeder volledig is opgelost, en vervolgens bewaard bij 4 °C. voorafgaand aan het gebruik wordt een 2000 U/mL trombine-oplossing toegevoegd aan de diffuse (Pluronische) inkt in een verhouding van 1:20, en gehomogeniseerd met behulp van een Thinky mixer. De voortvluchtige inkt wordt vervolgens geladen in een spuit (EFD Inc., East Providence, RI) bij 4 °C en gecentrifugeerd om eventuele luchtbellen te verwijderen. Voor het drukken wordt deze inkt minstens 15 minuten bij kamertemperatuur in evenwicht gebracht.

Bioprinten van perfuseerbare 3D proximale tubulusconstructies

3D PT-constructies worden vervaardigd met behulp van een op maat ontworpen, multimateriaal 3D-bioprinter uitgerust met vier onafhankelijk adresseerbare printkoppen gemonteerd op een 3-assige, bewegingsgestuurde portaal met een bouwvolume van 725 mm × 650 mm × 125 mm (AGB 10000, Aerotech Inc., Pittsburgh, PA USA). Inkten zijn ondergebracht in afzonderlijke spuitvaten waaraan sproeiers van verschillende grootte (d.w.z. 50 µm–410 µm diameter) zijn bevestigd via een luer-lock (EFD Inc., East Providence, RI, USA). Inkten worden geëxtrudeerd door depositie nozzles door het toepassen van luchtdruk (800 Ultra doseersysteem, EFD Inc., East Providence, RI, USA), variërend van 10-90 psi, overeenkomend met printsnelheden tussen 1 mm/s en 5 cm/s. we printen eerst de op maat gemaakte perfusiechippakking door de siliconeninkt af te zetten via een taps toelopend mondstuk van 410 µm op 50 mm × 75 mm glazen objectglaasjes. De pakking ontwerp is gemaakt met behulp van een aangepaste Matlab script dat G-code genereert voor een uiteindelijke pakking structuur. Na het afdrukken wordt de pakking van de perfusiechip bij 80 °C in een oven uitgehard voor >1 uur en vóór gebruik bij kamertemperatuur bewaard.

3d-PTs-patronen binnen de perfusiechip vereisen een combinatie van het gieten van de ECM en het afdrukken van de diffuse inkt. Ten eerste wordt de ECM-oplossing gecreëerd door 10 mg/mL fibrinogeen, 7,5 wt% gelatine, 2,5 mM CaCl2 en 0,2 wt% TG te combineren. Deze oplossing wordt dan in evenwicht gebracht bij 37 °C gedurende 15-20 min vóór gebruik om de optische helderheid van ECM25 te verbeteren. Vervolgens wordt de oplossing snel gemengd met trombine in een verhouding van 500:1, wat resulteert in een uiteindelijke trombineconcentratie van 1 E/mL. Binnen 2 min bij 37 °C volgt polymerisatie van fibrinogeen in fibrinegel. Daarom moet de ECM-oplossing onmiddellijk na het mengen met trombine op de basis van de perfusiechip worden gegoten. De basis ECM laag wordt dan toegestaan om iets te drogen onder stikstof, zodat het een vlak oppervlak vormt. De fugitive Pluronic f127 inkt (met 100 U / mL trombine) wordt gedrukt op de basis ECM laag in de vorm van een ingewikkelde filmament (tubule) met behulp van een taps toelopende 200 µm mondstuk. Een aangepast Python script (MeCode) wordt gebruikt om het gereedschapspad in G-code te specificeren. Direct na het afdrukken van diffuse inkt worden metalen holle perfusiepennen die door de Siliconenpakking zijn gekoppeld, in contact gebracht met de bedrukte inkt. Een toplaag van ECM wordt dan gevormd door de ECM-oplossing over de gedrukte tubulus te gieten, zoals hierboven beschreven, tot binnen 1-2 mm van de hoogte van de pakking wanden. Als cellen, zoals Hndf ‘ s, zijn opgenomen in de ECM (Fig. S5), worden ze direct na de equilibratieperiode gemengd, voorafgaand aan het trombine mengen en vervolgens gieten. Nadat de bovenste ECM-laag is gegoten, wordt de constructie bedekt met een glasplaatje om verdamping of verontreiniging te voorkomen en wordt deze 1 uur bij 37 °C gehouden om fibrinepolymerisatie te beëindigen en TG toe te staan het netwerk te crosslinken. De constructie wordt dan gekoeld tot 4 °C gedurende 15-20 min om de gedrukte diffuse inkt vloeibaar te maken, die uit het apparaat wordt gespoeld met behulp van koude celmedia, achterlatend open leidingen die dienen als het gewenste buisvormige netwerk ingebed in de ECM met of zonder cellen in de extratubulaire ECM-ruimte.

Met deze methode produceerden we ook 3D-architecturen in een laag-voor-laag-bouwsequentie. Bijvoorbeeld, elke individuele laag van de drie lagen structuur weergegeven in Fig. S10 is geconstrueerd met behulp van een aangepast printprotocol dat de eerder besproken materialen en methoden bevat. Na het printen van de eerste tubuli met fugitive inkt wordt een laag ECM over de print gegoten en 20 minuten gel bij 37 °C toegestaan voordat de volgende proximale tubulelaag met fugitive inkt wordt bedrukt bovenop de recent gelleerde laag. Deze opeenvolgende constructie introduceert 3D-geometrie en maakt een succesvolle evacuatie van alle kanalen onafhankelijk na de bouw mogelijk. Water-gebaseerde risico reactor kleurstoffen worden geperforeerd door de kanalen en opgewonden met UV-licht voor visualisatie.

om het 3D – weefselchipassemblageproces te voltooien, wordt elke PT-constructie op een bewerkte roestvrijstalen basis geplaatst en wordt er een dik acryldeksel bovenop geplaatst. Het deksel en de basis worden met vier schroeven aan elkaar geklemd en vormen een afdichting rond de bedrukte Siliconenpakking. Vervolgens wordt een steriele twee-stop peristaltische buis (PharMed BPT, interne diameter 0,25 mm) gevuld met media en aangesloten op de uitlaat van een steriel filter dat is bevestigd aan een 10 ml spuitvat (EFD Nordson), die dient als media reservoir. PTEC-media (ontworpen voor groei, dus ATCC-formulering plus 1% FBS, 1% aprotinine en 1% anti-anti) die zijn geëquilibreerd voor >3 uur in een incubator bij 37 °C, wordt 5% CO2 toegevoegd aan het mediasereservoir en wordt de slang van het reservoir aangesloten op de uitlaat van de chip (metalen holle perfusiepen). Een spuit wordt vervolgens gebruikt om lichte druk uit te oefenen op de media in de loop, waardoor deze wordt gedwongen om de bijgevoegde buis in te voeren en volledig te vullen. Het vullen van de slang met media voorafgaand aan het aansluiten op het circuit voorkomt de introductie van luchtbellen in het systeem. Om het perfusiecircuit te voltooien, wordt siliconen slang uit het reservoir aangesloten op de inlaat metalen perfusie pin op de chip. Slang pinch-off klemmen worden toegevoegd aan de inlaat en uitlaat van de perfusiechip om ongecontroleerde stroom te voorkomen wanneer losgekoppeld van de peristaltische pomp, die het epitheel kan beschadigen of luchtbellen in het systeem kunnen invoeren. Het mediasereservoir wordt te allen tijde in evenwicht gebracht met de atmosferische omstandigheden in de incubator door middel van een steriel filter bovenop het mediasereservoir.

celcultuur

menselijke vereeuwigde PTECs (Rptec / TERT1, ATCC CRL-4031) worden gekweekt volgens ATCC ‘ s instructies en worden gebruikt voor alle PT-modelstudies tot passage 20. Voor genexpressieanalyse worden menselijke primaire rptec (Cell Science), vereeuwigde ptecs (RPTEC-TERT1, Evercyte) en a498 (ATCC HTB-44) nierkankercellen gebruikt en gekweekt volgens de instructies van de leverancier. Menselijke neonatale huidfibroblasten( HNDF), GFP die (Angio-Proteomie) uitdrukken worden gecultiveerd per instructies van de leverancier en gebruikt tot passage 15.

Genexpressieanalyse

primaire humane rptec( Cell Science), vereeuwigde rptec-TERT1 (Evercyte) en a498 (ATCC HTB-44) nierkankercellen worden gekweekt in 96-wells platen volgens de instructies van de leverancier en verzameld op dag 3 na de samenvloeiing door het vervangen van kweekmedium door 100 µl/putje van 1x RNA-lysismengsel (Quantigeen Sample Processing Kit, QS0101). Vervolgens wordt 40 µl lysaat gemengd met een mRNA-capture magnetische parelset (Panomics QuantiGene Plex Set 12631, catalogusnummer 312631), ‘ s nachts geïncubeerd, verwerkt voor vertakte DNA-amplificatie en geanalyseerd volgens de instructies van de fabrikant (Panomics QuantiGene Plex Assay kit, QP1015). De ppib-sonde wordt gebruikt als huishoud-gen voor normalisatie. De gegevens van de fluorescentieintensiteit (FI) worden gepresenteerd als gemiddelde en standaardafwijking van 3 biologische replicaten.

Cytokine analyse van mediaperfusaat

Mediaperfusaat wordt verzameld uit een tubulus gedurende een periode van 25 dagen na het zaaien in de cel en bewaard bij -80 °C vóór de analyse. Voor cytokine-profilering worden de bovenstaande stoffen ontdooid op ijs, 2x verdund in monsterverdunningsbuffer (BioRad-catalogus #M60-009RDPD) en geanalyseerd met op Luminex-technologie gebaseerde ELISA met behulp van de Bio-Plex Pro ™ Human Chemokine IL-6 (Set # 171BK29MR2), IL-8 (Set #171-BK31MR2) en MCP-1 (Set #171-BK36MR2) en de Bio-Plex 200-systemen (BioRad) volgens de instructies van de fabrikant. De gegevens worden gerapporteerd als gemiddelde cytokineconcentraties en standaardafwijkingen van technische triplicaten.

epithelialisatie en longitudinale cultuur

elke 3D-PT-constructie wordt gedurende enkele uren geperfundeerd met PTEC-media in de incubator voorafgaand aan het laden / zaaien van cellen. PTECs (PTEC / TERT1, ATCC) zijn trypsinized van hun kweekschotel en geconcentreerd in media tot ~2 × 107 cellen/mL. De celsuspensie wordt vervolgens via de uitlaat in de perfusiechip geladen (Fig. S3b, c). De beladen constructie wordt zijdelings in de incubator geplaatst gedurende enkele uren en 180° gedraaid in de loop van meerdere intervallen van een half uur om een uniforme zaaien van de tubuluswanden mogelijk te maken, vervolgens geïncubeerd in de tubulus zonder stroom ‘ s nachts. De volgende dag worden niet-adherente cellen onder stroom door zwaartekracht uit de tubulus gespoeld. Perfusie van verse media wordt dan gestart en de resterende cellen beginnen te clusteren en dan groeien uit die kolonies (Fig. S3f) tot ze rond 3 weken na het zaaien samenvloeien (Fig. S3k). Tijdens de groeifase, worden PTECs gevoed PTEC media bereid volgens ATCC richtlijnen plus 1% aprotinine (EMD Millipore, gebruikt om de afbraak van het ECM te vertragen), 1% foetaal runderserum (FBS), en 1% antibioticum-antimycotisch (Gibco). Na rijping wordt FBS verwijderd en ptecs verpakt in een strakke epitheliale monolaag (film S2). Op Dag 1 na het zaaien worden de PTECs blootgesteld aan continue, unidirectionele stroom bij 1 µl/min, wat overeenkomt met schuifspanningen die variëren tussen 0,1 en 0,5 dynes/cm2, afhankelijk van de tubulusdoorsnede. Media worden gevoed via een peristaltische pomp in een gesloten kringloop en om de 2 dagen vervangen.

albumine opname studie

albumine opname wordt beoordeeld voor de geprinte 3D PT modellen en 2D controles. De eerste controle bestaat uit PTECs geteeld op Weefsel cultuur plastic, terwijl de tweede controle bestaat uit PTECs geteeld op onze ECM. In elk geval worden PTECs tot samenvloeiing gekweekt en mogen ze rijpen in serumvrije media. Humaan serumalbumine geconjugeerd met FITC (HSA-FITC, Abcam ab8030) wordt gesuspendeerd in PTEC media bij 50 µg/mL. Alle monsters worden gedurende 2 uur geïncubeerd met HSA-FITC in hun media (bij perfusie wordt deze door het open lumen geperfundeerd). Na blootstelling worden alle monsters gewassen met 3x volume en vervolgens trypsinized met 10x trypsine om de individuele cellen te verzamelen. De cellen worden gefixeerd en met primaire en secundaire antilichamen tegen megalin tegengegaan (tabel S2 vermeldt de specifieke gebruikte antilichamen). De cellen van die steekproeven, en Naakte cellen, worden geanalyseerd door cytometry stroom (Bd LSR Fortessa) en de gegevens worden verzameld van n = 10,000 cellen per steekproef. Om beelden van HSA-FITC en megalin in PTECs te verkrijgen, worden de steekproeven bevestigd met formaline in plaats van trysinized na de wasstap. Die steekproeven worden tegengestained voor megalin en imaged gebruikend confocal microscopie (Zeiss LSM710).

ciclosporine a-test

het effect van CysA op zowel 2D-controles als bioprinte 3D-PTs wordt onderzocht. In 2D, cellen worden gezaaid in een 96-well formaat op Weefsel cultuur plastic en gegroeid tot samenvloeiing. Ze worden gevoed media volgens ATCC richtlijnen. CysA (Sigma-Aldrich, SML1018) wordt in de media in verschillende concentraties gesuspendeerd en gedurende 24 uur met cellen geïncubeerd. een viabiliteitstest met (3-(4,5-dimethylthiazool-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyfenyl)-2-(4-sulfofenyl)-2H-tetrazolium) in aanwezigheid van fenazine-methosulfaat (MTS) wordt uitgevoerd bij 24 uur na blootstelling. Deze analyse wordt voltooid op ptecs bij vroege samenvloeiing, door CysA aan de cellen te geven op de dag dat zij samenvloeiing bereikten, evenals late samenvloeiing, door CysA verscheidene dagen nadat zij samenvloeiing bereikten te geven. Met name de toxiciteitsresultaten zijn voor elk geval gelijk (Fig. 5n). Voor 3D-PTs wordt CysA in verschillende concentraties gevoed door het Open lumen van volwassen tubuli na het bereiken van samenvloeiing (bij ~3 weken), waarbij gedurende minimaal 10 dagen geen serum in de media is opgenomen. Bij de 24 uur na blootstelling aan CysA wordt een lektest van FITC-dextraan (hieronder beschreven) uitgevoerd om verstoringen van de barrièrefunctie van PTECs te beoordelen en te kwantificeren. Direct daarna wordt de PT gefixeerd met 10% gebufferde formaline gedurende 1 uur en tegenbehandeld voor actine en DAPI (tabel S2 geeft een overzicht van de gebruikte specifieke vlekken).

diffusie permeabiliteitsmetingen

om de barrièrefunctie van het epitheel in 3D te beoordelen, wordt de diffusie permeabiliteit gekwantificeerd door ptec-media in het Open lumen te perfuseren die 25 µg/mL FITC-geconjugeerd 70 kDa dextran (FITC-Dex, Sigma-product 46945) bevatten met een snelheid van 15 µL/min gedurende 3 min en 1 µL / min daarna gedurende ~30-45 min. De volledige test wordt uitgevoerd onder levende celweergave met zowel de tubulus als het omringende ECM in het gezichtsveld (Fig. S9). Het diffusiepatroon van FITC-Dex wordt gedetecteerd met behulp van een Wide-field fluorescente microscoop (Zeiss Axiovert 40 CFL). De fluorescentiebeelden worden vóór perfusie en om de 3 tot 5 min over een periode van 30-45 min vastgelegd. Diffusiedoorlaatbaarheid van FITC-Dex wordt berekend door veranderingen in fluorescentieintensiteit in de tijd te kwantificeren met behulp van de volgende vergelijking34;

PD is de diffusiedoorlaatbaarheidscoëfficiënt, I1 is de gemiddelde intensiteit op een beginpunt, I2 is een gemiddelde intensiteit bij t ~ 30-45 min, Ib is achtergrondintensiteit (beeld genomen vóór perfusie van FITC-Dex), en D is de diameter van het kanaal. Andere onderzoekers hebben gemeld dat ptecs dextran39 kan resorberen, wat zou leiden tot iets hogere waarden voor de gemeten diffusiepermeabiliteit.

we onderzochten ook de barrièreeigenschappen van onze epitheliale beklede tubuli met behulp van een laagmoleculairgewichtverbinding, inuline (4,5 kDa) die niet wordt geresorbeerd of in vivo wordt uitgescheiden door PTECs met behulp van dezelfde methode die hierboven is beschreven. Specifiek wordt inuline-FITC (Sigma product F3272) opgelost in verwarmde ptec media bij 100 µg/mL en geperforeerd in het Open lumen met een snelheid van 20 µL/min gedurende 3 min en 1,5 µL/min daarna gedurende ~15 min. De volledige test wordt uitgevoerd onder levende celweergave met zowel de tubulus als het omringende ECM in het gezichtsveld (Fig. S7). Het diffusiepatroon van FITC-inuline wordt gedetecteerd met behulp van een Wide-field fluorescente microscoop (Leica). Fluorescentiebeelden worden vastgelegd met een omheinde lichtbron en bewegingsgestuurde fase vóór perfusie en elke 3 tot 5 minuten gedurende de periode van 15 minuten om technische triplicaatmetingen te verzamelen.

elektronenmicroscopie

voor transmissieelektronenmicroscopie (tem) worden PTECs in 2D-of 3D-architecturen of gezond humaan nierweefsel verkregen door een standaardbiopsie voorafgaand aan transplantatie gefixeerd met 2,5% glutaaraldehyde, 1,25% paraformaldehyde en 0,03% picrinezuur in 0,1 M natriumcacodylaatbuffer (pH 7,4) gedurende minimaal enkele uren. Kleine monsters (1 mm × 1 mm) worden verwijderd en gewassen in 0,1 m cacodylaatbuffer en baden in 1% osmiumtetroxide (OsO4) (EMS) en 1.5% potassiumferrocyanide (Kfecn6) (Sigma) gedurende 1 uur, 3x in water gewassen en gedurende 1 uur geïncubeerd in 1% waterige uranylacetaat (EMS) gevolgd door 2 wasbeurten in water en vervolgens dehydratie in verschillende soorten alcohol (elk 10 min.; 50%, 70%, 90%, 2 × 10 min. 100%). De monsters worden dan 1 uur in propyleenoxide (EMS) gedaan en ‘ s nachts geïncubeerd in een 1:1 mengsel van propyleenoxide en TAAB Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, Canada). De volgende dag worden de monsters ingebed in TAAB Epon en gepolymeriseerd bij 60 °C gedurende 48 uur. Ultrathin secties (ongeveer 60 nm) worden gesneden op een Reichert Ultracut-s microtoom, geplaatst op koperen roosters gekleurd met loodcitraat en onderzocht in een JEOL 1200EX transmissie elektronenmicroscoop en beelden worden opgenomen met een AMT 2k CCD camera. Beeldanalyse wordt uitgevoerd met behulp van ImageJ software.

voor scanning elektronenmicroscopie (SEM) worden perfused PTECS in 3D gefixeerd met 10% gebufferde formaline gedurende 1 uur. de monsters worden dun gesneden (~1 mm dik) om cellen bloot te leggen die het open lumen omringen. Het fixeermiddel wordt weggespoeld met PBSx2 en vervolgens dehydratie in verschillende soorten ethanol (20 min elk; 30%, 50%, 70%, 90%, 3 × 20 min. 100%). De monsters worden vervolgens gedurende 30 minuten in 50% ethanol en 50% hexamethyldisilazaan (HMD ‘s) geplaatst, gevolgd door 100% HMD’ s 3 × 30 min. Alle stappen worden uitgevoerd in een gesloten en verzegelde glazen container. Na het laatste wassen met HMD ‘ s worden de monsters verwijderd en in een open container onder N2 in de dampkap geplaatst om te drogen. Gedroogde monsters worden gemonteerd op aluminium pin mounts met behulp van geleidende carbon tape, sputter gecoat met goud, en imaged met een Tescan Vega SEM.

Immunostaining

Immunostaining gevolgd door confocale microscopie wordt gebruikt om de cellulaire lokalisatie van eiwitten in 2D-en 3D-ptec-modellen te beoordelen. Voorafgaand aan immunostaining wordt elke constructie gewassen met PBS en vervolgens gefixeerd gedurende 20 min tot 1 uur met behulp van 10% gebufferde formaline. Het fixeermiddel wordt verwijderd met verschillende wasbeurten in PBS gedurende enkele uren en vervolgens ‘ s nachts Geblokkeerd met behulp van 1 wt% bovine serum albumine (BSA) in PBS. Primaire antilichamen tegen de celproteã ne of biomarker van belang worden geïncubeerd met de constructies gedurende 1 dag bij de verdunningen vermeld in Tabel S2 in een oplossing van 0,5 wt% BSA en 0,125 wt% Triton X-100. Verwijdering van ongebonden primaire antilichamen vindt plaats met een wastap tegen een oplossing van PBS of 0,5 gew.% BSA en 0,125 gew.% Triton X-100 in PBS gedurende 1 dag. Secundaire antilichamen worden geïncubeerd met de constructen gedurende 1 dag bij de verdunningen vermeld in Tabel S2 in een oplossing van 0,5 gew.% BSA en 0,125 gew.% Triton X-100 in PBS. Monsters worden gekleurd met NucBlue of ActinGreen gedurende 2 uur en vervolgens gewassen voor 1 dag in PBS voorafgaand aan beeldvorming.

beeldweergave en-analyse

Fasecontractmicroscopie wordt uitgevoerd met behulp van een omgekeerde Leica DM IL scope met doelstellingen variërend van 1,25 x tot 40X. confocale microscopie wordt uitgevoerd met behulp van een staande Zeiss LSM 710 met waterdompeldoelstellingen variërend van 5X tot 40X, gebruikmakend van spectrale lasers bij golflengten van 405, 488, 514, 561 en 633 nm. Beeldreconstructies van z-stacks worden uitgevoerd in ImageJ met behulp van de Z-projectiefunctie met de instelling voor maximale pixelintensiteit. Elke toename van de helderheid wordt gelijkmatig uitgevoerd over een volledig z-geprojecteerd beeld. 3D – beeldreconstructies en roterende films (Movie S3) worden uitgevoerd met behulp van Imaris-software. De nieuwe CytoSMART (Lonza) in incubator systeem wordt gebruikt om time-lapse beeldvorming (film S2) vast te leggen. Beeldanalyse voor de kwantificering van diffusiepermeabiliteit wordt uitgevoerd met aangepaste Matlab-scripts met behulp van eerder gerapporteerde methoden34. Tem-beeldanalyse wordt uitgevoerd met behulp van ImageJ-software om celhoogte (n ≥ 50), microvilli-dichtheid (n ≥ 25) en microvilli-lengte (n ≥ 150) te meten over ten minste 3 onafhankelijke monsters voor elke aandoening.

statistische analyse

gegevens worden uitgedrukt als gemiddelden ± standaarddeviatie. Statistische analyse wordt uitgevoerd met MATLAB en statistische significantie wordt bepaald bij een waarde van p < 0,05, zoals bepaald door een ANOVA met behulp van Tukey ‘ s multiple pairwise comparison test. Verschillende significantieniveaus (p-waarden) worden aangegeven met sterretjes en Specifieke p-waarden worden gegeven in elke legenda van de figuur.