DOPIS

Neisseria meningitidis může způsobit potenciálně fatální systémové onemocnění. Včasná diagnóza a rychlá antimikrobiální intervence jsou rozhodující pro příznivé klinické výsledky. Rezistence na antibiotika byla hlášena u penicilinů (1), tetracyklinů (2) a sulfonamidů (3), stejně jako chinolonů (4) a rifampinu (5).

n. meningitidis vyjadřuje dvě hlavní porins, a PorA PorB, které jsou antigenně variabilní mezi kmeny a uvnitř kmen a PorA je fáze proměnné (náhodné on/off přepínání) (6). Neisseria gonorrhoeae vyjadřuje jediný porin, PorB. Změny v expresi porinu nebo variantní poriny zprostředkovávají rezistenci na antibiotika u několika gramnegativních bakterií, včetně n. gonorrhoeae (7,-10). U N. meningitidis nepřítomnost PorB zvyšuje rezistenci na tetracyklin a cefsulodin in vitro (11). Úloha PorA v antimikrobiální rezistenci nebyla u meningokoků hlášena. Kromě jeho navrhované roli v imunitní úniky, jsme předpokládali, že fáze-variabilní PorA výraz může poskytnout zřejmý mechanismus pro meningokok se vyhnout antimikrobiálních látek, pokud PorA zprostředkovává antibiotikum příjmu nebo vyloučení. Generovali jsme kmeny bez PorA nebo PorB a provedli jsme MIC testy. Testovali jsme také, zda je změněná exprese PorA vybrána antimikrobiální expozicí v průběhu testu MIC.

geny porA a porB s doprovodnými sekvencemi byly amplifikovány z kmene N. meningitidis MC58 a klonovány do pGEM T-easy. Inverzní PCR následovaná samoligací poskytla plazmidy s vnitřními delecemi a zavedla restrikční místa. Na LacZ/kanamycin kazety (12) byl klonován do představil Několik stránek odstraněny PorA alely, čímž se získá plazmid pPorALacZKan. Gen chloramfenikol acetyltransferázy byl amplifikován a klonován do zavedeného místa BglII odstraněné alely porB v plazmidu pPorB: CAT. Ten porA lacZ kan nebo porB::cat konstrukty byly transformovány do N. meningitidis kmen ¢9 (13) výnos kmeny ¢9ΔPorA a ¢9ΔPorB. Alelická náhrada alel divokého typu porA nebo porB s mutantní alelou byla potvrzena PCR a sekvenováním, stejně jako SDS-PAGE vnějších membránových proteinů extrahovaných Sarkosylem (obr. 1A).

MIC byla hodnocena vývar microdilution metoda v 96jamkových destičkách (14) pomocí bakterie pěstovány přes noc na doplněny BHI agaru při teplotě 37°C a subcultured třepání po dobu přibližně 4 h v BHI bujónu při 37°C před úpravou na přibližně 5 × 105 CFU/ml na základě optická hustota při 600 nm (OD600). Po přidání 50 µl do sériově ředit antibiotika, Mikrofony byly zaznamenány po růst přes noc při 37°C (Tabulka 1) jako koncentrace, při které žádný zákal byl pozorován. Každý test byl proveden třikrát, pokaždé ve trojím vyhotovení. Pro každé ošetření byly Mic identické v rámci a mezi testy.

naše výsledky potvrdily, že ztráta exprese meningokokového PorB zvyšuje rezistenci na tetracyklin (11). Mutace v PorB také přispívají k rezistenci na tetracyklin u N. gonorrhoeae (9, 15). Doporučená kombinovaná léčba mnohočetně rezistentních n. gonorrhoeae zahrnuje injekční ceftriaxon a perorální doxycyklin nebo azithromycin (16). V této souvislosti je pozoruhodné, že meningokokový mutovaný kmen ¢9ΔPorB měl sníženou citlivost na doxycyklin. Zaznamenali jsme sníženou citlivost na cefalothin pro ¢9ΔPorB a také pro cefalosporiny cefotaxim a ceftazidim. Předchozí zpráva spojovala mutaci PorB N. meningitidis se zvýšenou rezistencí na cefsulodin (11). V N. gonorrhoeae, varianty PorB loop 3 také přispívají ke zvýšené rezistenci na cefalosporin (17). Naše potvrzení, že Neisseria PorB moduluje cefalosporinová náchylnost zvyšuje možnost, že snížení citlivosti k této třídě mohou nastat klinicky nebo být usnadněno tím, že mutace v PorB v obou meningokok nebo gonokoky.

Fluorochinolonů používání se již nedoporučuje pro gonokoková infekce (18), a bodové mutace v PorB1b N. gonorrhoeae přispět ke snížení citlivosti N. gonorrhoeae na ciprofloxacin. Vyjádření změny v gonokoková porin změnit rezistence na ciprofloxacin (19); zjistili jsme, že mutace meningokokové PorB také za následek snížení ciprofloxacin citlivosti. Naopak, tento kmen byl náchylnější k rifampin, další hlavní volba pro meningokokové profylaxe, možná prostřednictvím změněné membránové architektury, jak bylo navrženo pro změněné rifamycin rezistence na kolistin-odolné Acinetobacter baumannii (20).

V kontrastu, jsme pozorovány žádné změny v citlivosti ¢9ΔPorA oproti PorA+ rodič napětí pro některou z testovaných antibiotik (Tabulka 1). To naznačuje, že buď PorA nemá žádnou přímou roli při vstupu antimikrobiálních látek do buňky nebo je tam výběr pro snížení PorA výraz přes fázi variace během MIC assay, a to buď v rodičovské kmen nebo v ¢9ΔPorB, potenciálně maskování PorA-zprostředkované antibiotikum vstupu. Posoudit to, že jsme izolovaných bakterií z konečné no, v nichž zákal byl pozorován a posuzován PorA výraz kolonie imunoblotingu pomocí anti-P1.7 myší monoklonální protilátka (MAb) MN14C11.6 (získané z NIBSC, Spojené Království). Jako kontroly byla reaktivita porovnávána mezi rodičovským kmenem ¢9 a kmenem mutantů PorA ¢9ΔPorA. To ukázalo, že exprese PorA byla nezměněna mezi kontrolními jamkami a po expozici některým z testovaných antimikrobiálních látek (viz obr. 1B); snížená citlivost ¢9ΔPorB tedy není způsobena změněnými hladinami exprese PorA.

naše výsledky jsou v souladu s předchozími zprávami o úloze N. meningitidis PorB u cefalosporinů a rezistence na tetracykliny (9, 11, 15). Paralely s gonokokovým PorB1b s ohledem na rezistenci na antibiotika jsou nápadné. Vyřazení porb exprese také snížilo meningokokovou citlivost na doxycyklin, jednu z doporučených terapií pro mnohočetně rezistentní n. gonorrhoeae. Problematicky to naznačuje, že selektivní tlak může vést ke vzniku gonokokových porb variant se sníženou citlivostí na doxycyklin. I když jsme zaznamenali pouze 2-krát rozdíly, které jsou nepravděpodobné, že by v izolaci, aby vést k selhání léčby, synergie PorB variace s jinými mutacemi má potenciál rozšířit meningokoková a gonokoková odpor spektra. Nenašli jsme žádný důkaz o úloze PorA v antimikrobiálním průchodu přes vnější membránu.