Metodologické Aspekty

Streptozotocin (2-deoxy-2-(3-methyl-3-nitrosoureido)-d-glucopyranose), antibiotikum s antineoplastickými účinky produkované Streptomyces achromogenes bakterie, selektivně ničí β-buněk pankreatických Langerhansových ostrůvku (Obr. 9.1).11 Streptozotocin indukuje přerušení řetězce DNA a alkylaci DNA, což vede k nekróze β-buněk pankreatu.12,13 Streptozotocin je transportován uvnitř β-buňky transportérem glukózy GLUT2, a proto je pro toxický účinek nutná exprese GLUT2.13,14 signální dráhy toxického účinku streptozotocinu zahrnují aktivaci indukovatelné NO-syntázy, zvýšení koncentrace NO, 15 a zvýšení generace H2O2.16

OBRÁZEK 9.1. Histologie a imunohistochemie pankreatických ostrůvků Langerhansových u kontrolních (levý panel) a streptozotocinem indukovaných diabetických (pravý panel) potkanů.

u diabetických potkanů byl počet a velikost ostrůvků snížen a imunoreaktivita inzulínu byla snížena.

vývoj diabetes mellitus po aplikaci streptozotocinu je velmi rychlý, zejména u potkanů. Citlivost β-buněk na glukózu je již výrazně snížena 2 hodiny po aplikaci streptozotocin; zničení a značné snížení počtu β-buněk dochází za několik hodin po aplikaci.17 To je doprovázeno změnami hladin glukózy a inzulínu v plazmě: 2 hodiny po aplikaci se vyvine hyperglykémie bez změn plazmatických a pankreatických hladin inzulínu, následovaná hypoglykemií se zvýšenými plazmatickými hladinami inzulínu, ale bez změny hladiny pankreatického inzulínu. Jeden den po aplikaci streptozotocin, krysy zobrazit všechny charakteristické příznaky diabetu, včetně hyperglykémie, glykosurie, polyurie, a snížené plazmatické hladiny inzulínu a slinivky břišní.18

Streptozotocin může být aplikován v jedné dávce nebo opakovaným způsobem, obvykle rozpuštěný v citrátovém pufru (pH 4.5), intravenózní, intraperitoneální nebo intraarteriální injekcí. V našich experimentech, diabetes byl spolehlivě vyvolané jednorázová intravenózní injekce streptozotocin rozpuštěn v citrátovém pufru v ocasní žíly v dávce 65 mg/kg tělesné hmotnosti. Dávka nezbytná pro indukci diabetu u potkanů se pohybuje mezi 40 a 60 mg / kg tělesné hmotnosti, i když někdy jsou hlášeny vyšší hodnoty.19 diabetické příznaky dobře korelují s použitou dávkou. Obecně platí, že při dávkách nižších než 40 mg / kg tělesné hmotnosti jsou pozorovány pouze mírné změny glykémie, glykosurie a plazmatických hladin inzulínu a tyto mírné změny mají tendenci se spontánně normalizovat až u 25% zvířat.18 při dostatečné dávce streptozotocinu je indukce diabetu u potkanů snadná, rychlá a spolehlivá. Ve většině studií využívající tento krysí model, nicméně, patogeneze diabetu a související příznaky byly studovány pouze na několik týdnů nebo měsíců, během nichž diabetes je plně vyvinutý a udržovaný. Dlouhodobé účinky streptozotocinu a možné zotavení z diabetu vyvolaného streptozotocinem byly zkoumány mnohem méně.

V našich experimentech jsme sledovali potkany s streptozotocin-indukované diabetes 1 rok, a zotavení byl pozorován významný podíl zvířat. Všech 152 potkanů vykazovalo plnohodnotný diabetes během prvních 6 měsíců experimentu, ve druhé polovině roku bylo možné jasně rozlišit dvě různé skupiny. V diabetické skupině (n = 92), glykemie zůstala vysoká (> 18 mmol/L), tělesná hmotnost nezvýšila, plazmatické hladiny inzulínu byly udržovány na nízké úrovni, a histologická analýza odhalila snížení počtu a velikosti pankreatických ostrůvků, s nedostatkem inzulínu-vylučovat buňky. Naproti tomu skupina zotavení (n = 60) vykazovala významné rozdíly ve druhé polovině roku, které nebyly přítomny v prvních 6 měsících experimentu: nižší glykémie (< 12 mmol/L), stále rostoucí tělesné hmotnosti a vyšší plazmatické hladiny inzulinu, který se přiblížil hodnoty zjištěné u kontrolních zvířat. Také histologická struktura pankreatických ostrůvků byla podobná struktuře u kontrolních zvířat s řadou dobře zachovaných β-buněk. Proto, po 6 měsících došlo k výraznému skupiny zvířat (∼ 40%), které vykazovaly výrazné oživení, s řadou parametrů, které se blíží hodnotám viděl v ovládání, non-diabetických zvířat. Jediným testem, který dokázal spolehlivě odlišit regenerační zvířata od nediabetických kontrol, byl test tolerance glukózy. Glukózový toleranční test byl proveden v 9 a 12 měsících experimentu, a křivka pro zotavení zvířat jasně ukázaly patologické hodnoty podobné diabetické skupině a se výrazně liší od těch, kontroly non-diabetických zvířat. Obě skupiny streptozotocinu reagovaly sníženou sekrecí inzulínu. Závěrem lze říci, že diabetes mellitus vyvolaný streptozotocinem u potkanů byl stabilní po dobu 6 měsíců; poté však došlo k významnému oživení u 40% zvířat. Funkční nedostatečnost zotavení v tomto období (7-12 měsíců po aplikaci streptozotocinu) může být odhalena testem tolerance glukózy. Sekrece inzulínu u regeneračních zvířat je pravděpodobně dostatečná v klidu; zvýšená glukózová zátěž však odhaluje stále zhoršenou glukózovou toleranci. U většiny zvířat (∼ 60%) nebylo pozorováno žádné zotavení a závažný diabetes přetrvával po dobu 12 měsíců. Spontánní zotavení z streptozotocin-indukované diabetes byl popsán již u novorozených potkanů, v níž streptozotocin byla použita při porodu,20 a u dospělých zvířat, ale s nízkou dávkou streptozotocin.21,22

Streptozotocin se také používá k indukci diabetu u jiných druhů, kromě potkanů. U myší může být diabetes typu I indukován buď jednou vyšší dávkou streptozotocinu, nebo opakovanou aplikací nižších dávek, obě aplikovaných intraperitoneálně. V případě jednorázové aplikace je popsána spolehlivá indukce pro dávky 200 mg / kg.23,24 vážnou nevýhodou jednorázové aplikace je velmi vysoká okamžitá letalita(až 90% pro 180 mg / kg v našich rukou). Opakovaná aplikace streptozotocinu se obvykle provádí s dávkami 40-50 mg / kg denně aplikovanými po dobu 5 po sobě jdoucích dnů.25 charakteristické diabetické příznaky (hyperglykémie, glykosurie, stagnující tělesná hmotnost) se vyvíjejí po aplikaci poslední dávky. Myši obvykle vykazují významné intergender rozdíly: u samců myší byly plazmatické hladiny glukózy po aplikaci streptozotocinu významně vyšší než u samic myší. Protože je známo, že podávání testosteronu zvyšuje hyperglykemickou odpověď u kastrovaných mužů a žen i u nekastrovaných žen, pravděpodobně přispívá k diabetogenním účinkům streptozotocinu.26

výsledky u morčete jsou kontroverzní. Podle některých studií jsou morčata rezistentní na diabetogenní účinky streptozotocinu.27 jiné studie naproti tomu popisují spolehlivý model morčete u diabetu indukovaného streptozotocinem na základě snížené rychlosti růstu, dysfunkce β-buněk, polydipsie, polyurie a glykosurie.28 rozdíly v experimentálních metodách indukce diabetu, zejména dávkování a aplikace, mohou být zodpovědné za tyto nesrovnalosti. Nejvíce vysoce doporučeno metody zahrnují intrakardiální aplikace streptozotocin (200 mg/kg) předchází podávání inzulínu,29 intrakardiální injekce streptozotocin (150 mg/kg) bez inzulínu,28 nebo intravenózní použití streptozotocin.30 na základě rozdílů ve způsobu indukce diabetu se mezi modely liší také diabetické parametry, časový průběh onemocnění a související letalita. V našich experimentálních podmínkách, vzhledem k tomu, že intraperitoneální aplikace streptozotocin (300 mg/kg) nezpůsobuje žádné příznaky diabetické, intravenózní podání streptozotocin (150 mg/kg) vedla k významnému glykosurie. Histologická analýza pankreatu neodhalila žádné známky destrukce ostrůvků, bez ohledu na způsob podávání streptozotocinu. I glykosurie pozorován po intravenózní podávání streptozotocin nemusí být příznakem diabetické, ale spíše výsledek přímý nefrotoxický účinek streptozotocin, která byla popsána u pacientů. Tato hypotéza je podpořena skutečností, že denní podávání inzulínu (5 IU / kg)nezabránilo glykosurii.

pokud jde o králičí model diabetu, jasně převažují studie využívající model indukovaný alloxanem. Studie s diabetem vyvolaným streptozotocinem u králíka jsou vzácné a protichůdné. Existují určité důkazy o diabetogenních účincích streptozotocinu u dospělých králíků i plodů, ale jiné studie argumentují proti této možnosti.27,31-34

u velkých savců byl streptozotocin úspěšně použit k indukci diabetu u psů a prasat. U psa byla aplikace streptozotocinu spojena s vysokou mortalitou,a proto bylo vyvinuto několik technik ke snížení dávky streptozotocinu a související mortality. Freyse et al.35 kombinovaná parciální pankreatektomie a infúze streptozotocinu v nízké dávce (2 mg / kg) do nadřazené pankreatoduodenální tepny. Jiné techniky patří kombinovaná intravenózní podání streptozotocin a alloxan, a suprarenální intraarteriální infuze streptozotocin a alloxan po balónková okluze juxtarenal břišní aorty.36,37 dalším velkým druhem savců citlivým na diabetogenní účinky streptozotocinu je prase (a minipig). Pro spolehlivý diabetogenní účinek streptozotocinu u prasat i minipigů je zapotřebí dávka 100-150 mg / kg.38 u miniprasat byla také hlášena úspěšná indukce diabetu dvěma nízkými dávkami (40 mg/kg).39