introduktion

midler, der inducerer eller initierer vasodilatation, udvidelse af blodkar, er vasodilatorer, som ofte anvendes til behandling af tilstande med unormalt højt blodtryk, såsom hypertension, angina og kongestiv hjertesvigt (Bader og Solty, 2010; , 2018). Typer af vasodilatorer med forskellige mekanismer, såsom calciumkanalblokker, ACE-hæmmere, cGMP-specifikke 3′,5′-cykliske phosphodiesterase (PDE5) – hæmmere og kaliumkanalåbnere, er blevet godkendt i clinic (Saji et al., 2014). På trods af overflod af vasodilatormuligheder skal nogle problemer, herunder universaliteten og sværhedsgraden af højt blodtryk, lægemiddelresistens og narkotikamisbrug, delvis løses ved udvikling af nye lægemidler (Oparil og Schmieder, 2015). Forskellig fra nuværende lægemidler med specifikke mål for at udvide blodkar, vi sigter mod at opbygge en alternativ strategi, der er i stand til systematisk at udforske vasodilatorer ved at rekapitulere det molekylære netværk af vasodilatation.

Systembiologiske tilgange er naturligt velegnede til at fange de upartiske, store aflæsninger fra komplekse systemer (Berger og Iyengar, 2009). Ekspressionsprofilbaserede metoder er de mest generelle, ved hjælp af transkriptionsprofiler som underskrifter af aktiviteten af en given vej, sygdom eller forbindelse for at opdage “forbindelser” mellem dem baseret på deres (anti)korrelerede transkriptionseffekter, såsom “Forbindelseskort” (Lamb et al., 2006). Inspireret af denne overvejelse er det udtænkt at opbygge specifikke funktionelle genmoduler af vaskulær fænotype fra genomskalaen funktionelt kort. Ændringer af modulerne skal være stærkt forbundet med patogenesen af vaskulær diameter. Modulerne kan bruges som forespørgsler til at undersøge den transkriptionelle respons af lægemidler til at identificere kandidat vasodilatorer.

traditionel kinesisk medicin (TCM), med naturlige urter som vigtige materialer, har spillet en afgørende rolle i menneskers sundhed i Kina. TCM involverer masser af aktive ingredienser, som normalt bruges som kilde til nye kemiske enheder til moderne lægemiddelopdagelse (Tian, 2011). Den seneste store samarbejdsindsats har produceret kompendier af molekylære profiler til urteingredienser (Lv et al., 2017). I det nuværende arbejde søger vi at opbygge en transkriptombaseret funktionel genmodulreference (TFGMR) strategi, der er i stand til at karakterisere funktionelle genmoduler relateret til vaskulær diameter i transkriptionsdataene for en samling urteforbindelser for at evaluere virkningen af disse forbindelser på den vaskulære diameter.

materialer og metoder

Genekspressionsdata og forbehandling

Genekspressionsdata for urteforbindelser blev opnået fra en systematisk undersøgelse af TCM-komponenter ved anvendelse af genekspressionsmikroarray-teknikken (Lv et al., 2017). Disse små forbindelser var almindelige i kinesiske urter og TCM-formler, og de fleste af dem er kvalitetskontrolkomponenterne i TCM ‘ er fra China Pharmacopoeia. Genekspressionsdataene blev afledt af den humane brystkræftepitelcellelinie (MCF7) behandlet med disse urteforbindelser, profileret ved hjælp af mikroarray-teknologi med Affymetriks humant genom U133A 2.0 og indsamlet fra National Center for Biotechnology Information (NCBI) genekspression Omnibus (GEO-seriens tiltrædelsesnummer: GSE85871). Rådataene (CEL-filer) blev behandlet konsekvent ved at anvende den platformspecifikke procedure til at filtrere og normalisere datasæt. Derefter blev de differentielle genekspressionsværdier versus kontrolprøver beregnet for hver urteforbindelse ved hjælp af R-pakke” Limma ” (version 3.32.7). Genlisten for hver forbindelse blev produceret ved at bestille gener i en rangeret liste i henhold til deres differentielle ekspressionsværdier.

identifikation af funktionelt Genmodul til regulering af Blodkardiameter

to funktionelle genmoduler, der positivt og negativt regulerer blodkardiameter (PFGM og NFGM) blev konstrueret i dette arbejde. For det første blev to Gen ontologi (go) biologiske processer (bps) “positiv regulering af blodkardiameter” (GO: 0097755) og “negativ regulering af blodkardiameter” (GO: 0097756) indsamlet fra Hurtiggo: et internetbaseret værktøj til GO-søgning (http://seek.princeton.edu/) (Ju et al., 2015). De resulterende gener med co-ekspressionsscore > 0 og P-værdi < 0.01 I SEEK blev betragtet som co-udtrykte gener af forespørgselskernegener. Endelig blev de overlappende gener i to gensæt fjernet, og resten gener sammensat henholdsvis PFGM og NFGM (supplerende tabel 1 og 2).

Berigelsesanalyse af funktionelle Genmoduler i Urteforbindelsesinducerede Genekspressionsprofiler

berigelserne af PFGM og NFGM med urteforbindelsesinducerede genekspressionsprofiler blev evalueret ved anvendelse af gensæt berigelsesmetoden (GSEA), implementeret i r–pakkerne, “GSEA–P” (Subramanian et al., 2005). GSEA beregner Berigelsesscore (r) for gensæt med hensyn til den rangerede liste. ES-værdiområdet er . Det er en foranstaltning baseret på Kolmogorov–Smirnov-statistikken og evaluerer overrepræsentationen af gensæt i ekstremerne (øverst eller nederst) på den rangerede liste. Jo tættere ES er på 1, jo tættere er generne øverst på listen (gener har tendens til at blive øget i tilstanden). Jo tættere på -1, jo tættere er generne nederst på listen (gener har tendens til at blive reduceret i tilstanden).

i dette arbejde repræsenterer PFGM og NFGM molekylære signaturer af blodkarets diameter. For at evaluere virkningerne af urteforbindelser på blodkardiameteren blev ES-værdierne (ESPFGM og ESNFGM) af PFGM og NFGM målt for hver sammensat induceret genekspressionsprofil. Værdien TES = ESPFGM-ESNFGM blev brugt som et indeks til at vurdere indflydelsen af hver urteforbindelse på blodkardiameteren. For en forbindelse, jo større dens tes-værdi er, desto stærkere er dens evne til at udvide blodkar. Jo mindre dens tes-værdi er, desto stærkere er dens evne til at indsnævre blodkar.

karakterisering af de sammensatte regulerede gener i PFGM og NFGM

i dette arbejde svarer dets regulerede gener i PFGM og NFGM til den førende delmængde, der er defineret til at være kernemedlemmerne i de to moduler, der bidrager til ES i GSEA-metoden. Den førende delmængde kan fortolkes som kernen i et gensæt, der tegner sig for berigelsessignalet. Den førende delmængde af PFGM og NFGM for hver sammensat induceret genekspressionsprofil kan ekstraheres ved metoden implementeret i r-pakkerne, GSEA-P.

kemikalier og stoffer

ferulinsyre (98% renhed), likiritin (98% renhed), magnolol (98% renhed) og ginsenosid Rb2 (93,8% renhed) blev opnået fra National Institutes for Food and Drug Control (NIFDC, Beijing, Kina). Borneol (98% renhed), ginsenosid Rc (98% renhed), artemisinin (99% renhed), chenodeoksycholsyre (98% renhed), daidsin (98% renhed) og bacopasid i (98% renhed) blev købt hos Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd. Andre reagenser var af analytisk renhed.

forsøgsdyr

fyrre mandlige Sprague-Dauley (SD) rotter, der vejer 230-250 g i en alder af 7-9 uger og blev købt fra Animal Breeding Center Of Beijing Vital River Laboratories Company (Beijing, Kina). Rotterne blev opretholdt under en 12 timers lys/mørk cyklus og havde fri adgang til mad og vand. Dyrene blev taget hånd om af China Academy of Chinese Medical Sciences’ Laboratory Animal Care Center. Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med anbefalingerne fra institutionelle retningslinjer og etik. Protokollen blev godkendt af Animal Ethical and velfærd Committee, China Academy of Chinese Medical Sciences.

fremstilling af Aortaringe til spændingsmålinger

eks vivo-eksperimentet blev udført på thoracale aortaer af rotter i henhold til den tidligere beskrevne protokol (Chen et al., 2019). Rotterne blev nemlig bedøvet ved intraperitoneal injektion af chloralhydrat og blev derefter ofret ved cervikal dislokation. Efter åbning af brystet blev rotternes thorakale aortaer opnået og blev straks anbragt i iskold Krebs-Henseleit (KH) opløsning af følgende sammensætning (i mmol/L): NaCl 120, KCL 4,8, MgSO4•7h2o 1,2, KH2PO4 1,2, CaCl2 2,5, NaHCO3 25 og glucose 11 (pH 7,4). Fedtvævet, der klæber til arterierne, blev forsigtigt fjernet for at undgå endotelcelleskader, og blodkaret blev skåret i cirka 3 mm lange ringe. I de endotel-denuderede eksperimenter blev endotelet mekanisk fjernet ved forsigtigt at gnide den luminale overflade af aortaringen frem og tilbage flere gange med plastrør. Aortaringe blev suspenderet i orgelbade indeholdende 5 ml KH-opløsning ved 37 liter C Gasset med 95% O2 + 5% CO2, som blev opretholdt konstant gennem eksperimenterne. Efter ækvilibrering under ingen spænding i 20 minutter fik aorta-ringene lov til at ækvilibrere i 90 minutter ved en hvilepænding på 1,0 g. i ækvilibreringsperioden blev KH-opløsningen ændret hvert 20.minut. Ændringer i spænding blev registreret af krafttransducere (FT-102, Chengdu Techman Co., Ltd. Kina) tilsluttet et dataindsamlingssystem (BL-420f, Chengdu Techman Co., Ltd. Kina) og blev gemt på en computer. For at sikre undersøgelsens nøjagtighed og repeterbarhed blev 3,0–4,5 g desuden valgt som inklusionskriterium for prækontraktil kraft ifølge foreløbige forsøg.

virkninger af urtekomponenter på sammentrækning induceret af phenylephrin

Ved den stadige sammentrækning induceret af phenylephrin (Phe) (1 liter/L) i aortaringe blev en kumulativ koncentration af urtekomponenter (opløst i KH-opløsning eller indeholdende 0,2% DMSO) tilsat direkte til organbadet, og virkningen af urtekomponenten blev registreret. Det samme volumen KH-opløsning blev tilsat til køretøjets kontrolgruppe, og responserne blev stoppet ved at vaske aortaringene med frisk KH-opløsning. Virkningerne blev udtrykt som procentdelen af afslapning induceret af urtekomponenter.

dataanalyse

for det første for at vurdere betydningen af virkningerne af urteforbindelser på den vaskulære fænotype repræsenteret af de to funktionelle moduler, beregnede vi en nominel P-værdi for hver TES-værdi ved at sammenligne fordelingen af den faktiske værdi med en nulmodel, der opnåede TES-værdier for hver forbindelse ved tilfældigt prøveudtagning af genmedlemmer af PFGM og NFGM 1.000 gange med bevarede tal af de to moduler (supplerende tabel 3). For det andet blev betydningen af den overlappende analyse mellem reguleringen af de seks forbindelser med afslappende virkninger målt ved Fishers nøjagtige test (supplerende tabel 5). Endelig følger den statistiske analyse af den funktionelle annotation af gensæt i Gestalt (http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/annotate.jsp) instruktionerne på den tilsvarende hjemmeside.

Vasorelaksatorisk aktivitet udtrykkes som procentvis lempelse af Phe (1 prismol / L) forkontraktionsniveauer. Værdier udtrykkes som middelkrær SD for resultaterne af de otte prøver. Forskelle på tværs af grupperne blev bestemt ved envejsanalyse af varians. Statistisk signifikans blev defineret som P < 0.05. Koncentrationen for 50% af maksimal effekt (EC50) værdier af in vitro-eksperimenter blev opnået ved ikke-lineær regression. Generering af grafer og statistisk analyse blev udført ved hjælp af GraphPad Prism (GraphPad-program, version 5.01) og SPSS 18.0-program.

resultater

Transkriptombaseret funktionelt Genmodulreference

Vi præsenterer en tfgmr-strategi, der er i stand til at berige sygdomsrelaterede funktionelle genmoduler i lægemiddelinducerede transkriptionsprofiler for at detektere lægemidlers terapeutiske evne til sygdomme ved at regulere specifikke funktionelle mekanismer. Her anvendes TFGMR til transkriptomressourcer til 102 urtekomponenter for systematisk at opdage nye vasodilatorer ved at regulere blodkardiameter (Figur 1). For det første konstruerede vi to funktionelle genmoduler PFGM og NFGM, der positivt og negativt regulerer blodkardiameter. PFGM indeholder 167 genmedlemmer, hvoraf 55 kernegener afledt af GO BP “positiv regulering af blodkardiameter” (GO: 0097755) og 112 co-udtrykte gener af kernegenerne (supplerende tabel 1). NFGM indeholder 122 medlemmer, herunder 72 kernegener fra GO BP “negativ regulering af blodkardiameter” (GO: 0097756) og deres 50 co-udtryk (supplerende tabel 2). Derefter, vi undersøgte berigelsen af både PFGM og NFGM til hver af de urteforbindelsesinducerede genekspressionsprofiler ved GSEA–tilgang til at vurdere effekten af hver urteforbindelse på blodkardiameteren.

karakterisering af funktionelt Genmodul til regulering af Blodkardiameter

Vi karakteriserede PFGM og NFGM med hensyn til både Go-og vejberigelse for at vurdere den funktionelle tilknytning af de to moduler med den vaskulære fænotype ved hjælp af Liao et al., 2019). GO-analysen af top 10 BPs viste, at både PFGM og NFGM involverer de samme BPs af “divalent uorganisk kationhomeostase”, “regulering af anatomisk strukturstørrelse”, “cirkulationssystemproces”, “muskelsystemproces”, “G–proteinkoblet receptor signalvej” og “anden messenger-medieret signalering” (figur 2). Tilsvarende viste vejanalyse af top 10 Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) veje, at de to moduler var signifikant involveret i veje til “regulering af lipolyse i adipocytter”, “cyklisk guanosinmonophosphat (cGMP)-cGMP-afhængig proteinkinase (PKG) signalvej”, “calcium signalvej”, “vaskulær glat muskelkontraktion” og “neuroaktiv ligand–receptor interaktion” (figur 2). Både gå-og vejbetingelser beriget for PFGM og NFGM er naturligvis relateret til den vaskulære fænotype.

forudsigelse af kandidat vasodilatorer fra urtekomponenter af Tfgmr

vores antagelse er, at vasodilatorer for det meste skal øge ekspressionen af PFGM (ESPFGM> 0) medlemmer og formindske nfgm (ESNFGM< 0). Derfor blev værdien TES = ESPFGM-ESNFGM valgt som et indeks for at identificere kandidat vasodilatorer. For en forbindelse, jo større dens tes-værdi er, jo højere er dens evne til at udvide blodkar. De bestilte genlister blev først produceret til de 102 urtekomponentinducerede genekspressionsprofiler. Derefter blev GSEA-metoden anvendt til at måle TES-værdien for hver urteforbindelse. De 102 forbindelser blev ordnet efter deres tes-værdier og beskrevet i supplerende tabel 3. De 10 bedste kandidatforbindelser og deres tes-værdier blev anført i tabel 1.

de Vasorelaksante virkninger af Top 10 Kandidatkomponenter på Phe-kontraherede Aortaringe

de vasorelaksante virkninger af de top 10 forudsagte kandidat vasodilatorer blev evalueret på vaskulær spænding af endotel-intakte thoracale aortaringe indsnævret af Phe. Typisk originalt spor viste, at KH-opløsning (kontrolgruppe, indeholdt 0,2% DMSO) ikke slappede af vaskulære ringe, der var prækonditioneret med Phe (supplerende Figur 1). Sammenlignet med kontrolgruppen viste alle de 10 urtekomponenter signifikante og dosisafhængige vasorelaksante virkninger på Phe-kontraherede aortaringe (P < 0,05, figur 3). Blandt dem præsenterede ferulinsyre den mest kraftfulde vasodilatation (Emaks = 87,46 2,90%), mens den mindste styrke blev fremkaldt af væskritin (Emaks = 11,10 3,34%) (figur 3 og tabel 1). Dette høje niveau på nye forudsigelser indikerede, at tfgmr-strategien er praktisk anvendelig til forudsigelse af nye vasorelaksantmidler og har potentielle anvendelser inden for lægemiddeludvikling.

Afledningsmekanismer af naturlægemidler forbindelser med Vasorelaksant virkninger

de seks forbindelser med åbenlyse afslappende virkninger blev undersøgt for deres tilsvarende mekanismer baseret på deres regulering på PFGM og NFGM. For det første undersøgte vi kernegener, der er signifikant reguleret i de to moduler af de seks forbindelser. For hver forbindelse er de regulerede gener medlemmerne i den førende delmængde af berigelsesanalysen (se materialer og metoder). Som vist i supplerende Tabel 4 påvirker ferulinsyre, borneol, daidsin, magnolol, chenodeoksycholsyre og artemisinin 67, 59, 50, 58, 59, og 59 gener i PFGM, og 52, 49, 39, 44, 44, og 43 gener i NFGM, henholdsvis. De regulerede gener af disse forbindelser blev sammenlignet, og det blev fundet, at de regulerede gener for de seks forbindelser signifikant overlapper hinanden (supplerende tabel 5, Fishers nøjagtige test P << 0,01), hvilket antyder, at de seks forbindelser deler lignende mekanismer for deres afslappende virkninger. Dette blev yderligere valideret ved den funktionelle analyse af disse regulerede gener af disse forbindelser. I de top 27 berigede go-termer berigede de regulerede gener af de seks forbindelser signifikant i otte samme GO-termer relateret til vaskulær fænotype, herunder vaskulær proces i kredsløbssystemet, regulering af vasokonstriktion, regulering af rørstørrelse, regulering af systemproces, regulering af blodcirkulation, regulering af anatomisk strukturstørrelse og kredsløbssystemproces. Udover de lignende mekanismer har hver forbindelse også sin eksklusive mekanisme. For eksempel kan ferulinsyre og chenodeoksycholsyre regulere gener i GO sigt “ion homeostase.”Borneol påvirker gener betydeligt i GO-termer “regulering af cellulær komponentbevægelse” og “biologisk vedhæftning” (figur 4 og supplerende Tabel 6).

Diskussion

højt blodtryk bidrager til de patofysiologiske konsekvenser af de fleste hjerte-kar-sygdomme. Hæmning eller reversering af højt blodtryk er således en uvurderlig strategi til behandling af hjerte-kar-sygdomme og relateret organskade (Carey et al., 2018). Selvom der har været mere end 69 lægemidler i 15 forskellige klasser af antihypertensive stoffer, såsom calciumantagonister, angiotensin-konverterende inhibitorer, larr-adrenoceptorantagonister, diuretika og direktevirkende vasodilatorer, har mange flere hypertensive patienter resistent hypertension eller er ukontrollerede for ikke-adherens eller intolerance over for tilgængelige antihypertensive midler (Oparil og Schmieder, 2015). Derfor er der stadig behov for nye agenter for at bekæmpe højt blodtryk. TCM ‘ er indeholder for det meste hundredvis af kemiske komponenter, som er stofbasis for TCM-farmakologi og giver en rigelig kilde til kemisk lægemiddelopdagelse. I dette arbejde undersøgte vi systemisk virkningerne af urteingredienser på den vaskulære fænotype ved hjælp af en transkriptombaseret tilgang, TFGMR.

vaskulær spænding er rapporteret at spille en kritisk rolle i reguleringen af blodtrykket. En af de dominerende mekanismer for antihypertensive lægemidler er at reducere vaskulær resistens ved vasodilation. I denne undersøgelse er vasorelaksante virkninger af de 10 bedste kandidatkomponenter blevet undersøgt. Resultaterne viste, at alle de 10 komponenter har forskellige grader af vasodilatation. Blandt dem havde ferulinsyre, borneol og daidsin stærke afslappende virkninger, hvilket er i overensstemmelse med tidligere fund (Susuki et al., 2007; Deng et al., 2012; Silva-Filho et al., 2012; Jens et al., 2014; Jens et al., 2017; Santos et al., 2019). Magnolol, artemisinin og chenodeoksycholsyre fremkaldte en moderat afslapning, også i overensstemmelse med rapporterne fra de tidligere undersøgelser (Teng et al., 1990; Li et al., 2005; Seok et al., 2012; Jørgen et al., 2017). Derudover rapporterede vores arbejde først de vasorelaksante virkninger af fire urteforbindelser, likiritin, ginsenoside Rc, bacopaside i og ginsenoside Rb2, selvom effekten er lav (emaks (% Phe) < 30%, tabel 1). Interessant nok blev det konstateret, at de vasorelaksante virkninger af nogle af disse komponenter var i overensstemmelse med de farmakologiske virkninger af deres originale urter (se detaljer i supplerende Tabel 7). For eksempel er ferulinsyre og magnolol hovedkomponenter i TCM “chuangsiong” (Ligusticum Chuangsiong Hort) og “houpo” (Magnolia officinalis Rehd. et vil), henholdsvis. I TCM-teorien kunne disse urter fremme” Chi ” – cirkulation i kroppen, fjerne vind og eliminere fugt i tråd med teorien om vasodilatation (Liu et al., 2017). Dette fund antydede, at tfgmr-strategien er en velegnet model til at forudsige de vasorelaksante virkninger af TCM.

Genekspressionsprofiler kan bruges som en underskrift af aktiviteten af et givet lægemiddel eller en sygdom for at finde forbindelserne mellem lægemidler og sygdomme ved hjælp af deres transkriptionelle reaktioner (Lamb, 2007; Subramanian et al., 2017). Den ekspressionsprofilbaserede metode er blevet brugt til omplacering af lægemidler, målforudsigelse og opdagelse af immunmodulerende virkninger af lægemidler (Iorio et al., 2010; Sirota et al., 2011; Kidd et al., 2016; Li et al., 2019). Med mere finkornede, store omics – datasæt bliver offentligt tilgængelige, tillader den nuværende viden en mere præcis afgrænsning af det biologiske modul/netværk af patologiske processer. Vi identificerede og kommenterede her to kardiameterrelaterede genmoduler PFGM og NFGM, ved at undersøge gener involveret i den positive og negative regulering af kardiameteren fra et genomskala genfunktionelt kort.

TFGMR bruges til at karakterisere berigelsen af PFGM og NFGM i de urtekomponentinducerede genekspressionsprofiler og definere en TES–værdi for hver urtekomponent for at måle dens vasorelaksante virkning. De vasorelaksante virkninger af de top 10 kandidat urtekomponenter blev undersøgt ved eks vivo eksperimenter med aortaringkontraktion induceret af Phe. Blandt dem fremkaldte seks forbindelser, ferulinsyre, borneol, magnolol, artemisinin, chenodeoksycholsyre og daidsin en åbenbar afslapning (Emaks (% Phe) > 50%, tabel 1) og kan anvendes som potentielle terapeutiske midler til sygdomme med højt blodtryk.

det skal bemærkes, at selv om kun en database med urtekemikalier blev testet af TFGMR, er metoden faktisk egnet til screening af kemikalier, for hvilke handlingerne på genekspressionsniveauerne er kendt. Derudover skal kandidatforbindelserne testes for deres direkte virkninger på udvidelse af modstandsbeholdere, som vil blive evalueret ved laser Doppler-strømningsmetri i yderligere arbejde.

Datatilgængelighedserklæring

offentligt tilgængelige datasæt blev analyseret i denne undersøgelse. Disse data kan findes her: NCBI genekspression Omnibus, GEO-serie tiltrædelsesnummer: GSE85871.

Etikerklæring

dyreforsøget blev gennemgået og godkendt af China Academy of Chinese Medical Sciences’ Laboratory Animal Care Center.

Forfatterbidrag

pl og CC designede forskning, udførte eksperimenter, analyserede data og skrev manuskriptet. Dy og SL udførte eksperimenter og indsamlede og analyserede data. JS og AL overvågede værket og skrev og gennemgik manuskriptet.

Funding

denne forskning blev støttet af National Natural Science Foundation of China (No. 81703945, No. 31800678) og teknologi-og Innovationsfonden i Shanksi Agricultural University (No. 2016yj17, No. 2017yj40).

interessekonflikt Erklæring

forfatterne erklærer, at forskningen blev udført i mangel af kommercielle eller økonomiske forhold, der kunne fortolkes som en potentiel interessekonflikt.

supplerende materiale

det supplerende materiale til denne artikel kan findes online på: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2019.01144/full#supplementary-material