regulering af Hjertesarkoplasmatisk retikulum Ca2+ optagelse af Phospholamban

i begyndelsen af 1970 ‘ erne blev en opdagelse rapporteret af Arnold kats (Tada et al1), der demonstrerede, at phosphorylering af isolerede hjertesarkoplasmatiske retikulummembraner forekom hovedsageligt på et protein med lav molekylvægt. Dette phosphoprotein blev navngivet phospholamban, fra de græske rodord, der betyder ” at modtage fosfat.”1 Phospholamban er et lille protein, der omfatter 52 aminosyrerester, og det er til stede i hjerte -, glatte og langsomt træk skeletmuskler. Imidlertid er dens regulatoriske virkninger hovedsageligt undersøgt i hjertemuskel. In vitro-undersøgelser viste, at phospholamban kan phosphoryleres på tre forskellige steder af forskellige proteinkinaser: serin 10, ved proteinkinase C; serin 16, ved cAMP – eller cGMP-afhængig proteinkinase; og threonin 17, Ved Ca2+-calmodulin–afhængig proteinkinase.23 Hver phosphorylering er forbundet med stimulering af de indledende hastigheder for hjertesarkoplasmatisk retikulum Ca2+ – optagelse, som hovedsageligt udtales ved lav , hvilket resulterer i en samlet stigning i affiniteten af Ca2+ – pumpen til Ca2+.45 på baggrund af disse observationer blev det oprindeligt antaget, at phosphoryleret phospholamban fungerer som en stimulator for det kardiale sarkoplasmatiske retikulum Ca2+-ATPase (SERCA2). I slutningen af 1980 ‘ erne opstod der imidlertid et signifikant gennembrud, der demonstrerede, at dephosphoryleret phospholamban faktisk er en hæmmer af hjertesarkoplasmatisk retikulum Ca2+ transport for Ca2+, og at phosphorylering lindrer denne hæmmende virkning, hvilket giver udseendet af phosphoryleringsinduceret stimulering.6 dette fund sammen med identifikationen af en hjertesarkoplasmatisk retikulumassocieret proteinphosphatase,der kan dephosphorylere phospholamban, 7 har ført til vores nuværende forståelse af phospholamban som en reversibel hæmmer af det hjertesarkoplasmatiske retikulum Ca2+ ATPase–aktivitet.

Phospholamban phosphoryleres også in situ under LARP-adrenerg stimulering. Undersøgelser i intakte bankende hjerter eller isolerede hjertemyocytter har vist, at både serin 16 og threonin 17 i phospholamban bliver phosphoryleret under isoproterenolstimulering.89 phosphorylering af phospholamban og de ledsagende stigninger i det kardiale sarkoplasmatiske retikulum Ca2+ optagelseshastigheder blev antydet at være i det mindste delvist ansvarlig for de stimulerende virkninger af LARP-agonister i pattedyrets hjerte.

strukturelle egenskaber ved Phospholamban

strukturen af phospholamban er ikke i øjeblikket kendt, men baseret på dets aminosyresekvens er flere modeller blevet foreslået. Det er generelt accepteret, at der er to store domæner: et hydrofilt domæne (AA 1-30, hvilket indikerer aminosyrerester 1 til 30), som indeholder de tre phosphoryleringssteder, og et hydrofobt domæne (AA 31-52), som er forankret i den kardiale sarkoplasmatiske retikulummembran. En del af det hydrofile domæne er blevet foreslået at være i en spiralformet konfiguration, og phosphorylering af phospholamban kan slappe af eller forstyrre denne strukturelle konfiguration.10 beviser fra flere laboratorier indikerede vigtigheden af det hydrofile domæne ved formidling af de regulatoriske virkninger af phospholamban på det kardiale sarkoplasmatiske retikulum Ca2+ – pumpe.6111213 faktisk er AA 2-18 i phospholamban blevet foreslået at interagere med AA 336-412 og 467-762 i SERCA2 til funktionel modifikation.14

det hydrofobe domæne af phospholamban er også blevet foreslået at have en spiralformet struktur. Der er i øjeblikket ingen klare beviser for, at dette domæne interagerer med det kardiale sarkoplasmatiske retikulum Ca2+ pumpe, skønt flere undersøgelser har antydet, at den hydrofobe del af phospholamban også er vigtig for at formidle de regulatoriske virkninger.1215 Cysteinrester i det kur-spiralformede transmembrandomæne tilvejebringer ikke-kovalent interaktion mellem monomere former og bidrager til stabilisering af en pentamerisk struktur for phospholamban.16 analyse af phospholamban pentamerer viste, at pentamer dannelse var, at en venstrehåndet oprullet-spole spiralformet bundt, med en cylindrisk ion pore.17 nylige beviser viste,at en leucin lynlås stabiliserer phospholamban pentameric association og danner en central ion pore, 18 som kan muliggøre Ca2+-selektiv ionoverførsel.19 Det er imidlertid ikke i øjeblikket klart, om pentamerisk samling er essentiel for funktionel regulering af det kardiale sarkoplasmatiske retikulum Ca2+ ATPase. Ekspressionsundersøgelser i cellefrie systemer har vist, at de monomere og pentameriske former for phospholamban er lige så effektive til at formidle de regulatoriske virkninger på Ca2+ – pumpen.14

en anden teori om phospholamban–Ca2+-ATPase-interaktion foreslog en dimerisk forening af Ca2+ – pumpeproteinerne omkring en phospholamban-pentamer.20 denne model, baseret på tidsopløst phosphorescensanisotropi, beskrev en præferentiel interaktion mellem den Ca2+-fri pumpe og dephosphoryleret phospholamban. Phospholamban phosphorylering destabiliserede interaktionen og resulterede i øget rotationsmobilitet af Ca2+-ATPase i den kardiale sarkoplasmatiske retikulummembran.20

regulering af Basal Myocardial kontraktilitet med Phospholamban

phospholambans rolle i reguleringen af basal myocardial kontraktilitet er for nylig blevet belyst gennem udviklingen af en phospholamban-mangelfuld mus.21 disse mus, der blev oprettet ved hjælp af genmålretningsmetode i murine embryonale stamceller, viste hyperdynamisk hjertefunktion, herunder øget systolisk funktion,øgede satser på venstre ventrikulær afslapning, 21 og forbedret ventrikulær fyldning.22 phospholamban-mangelfulde hjerter slappede ikke kun hurtigere af end vildtypehjerter, men udviste også forbedrede inotrope parametre, inklusive øgede hastigheder for trykudvikling, som blev vurderet i arbejdsudførende præparater21 og in vivo ved hjælp af ekkokardiografiske analyser.22 Disse fund blev underbygget ved in vitro-analyser af isolerede ventrikulære kardiomyocytter fra phospholamban-mangelfulde hjerter, som også udviste forbedring af hastigheden for relengthening, forkortelse og Ca2+ kinetik.23 de forbedrede kontraktile parametre afspejlede subcellulære ændringer på det kardiale sarkoplasmatiske retikulumniveau. Affiniteten af Ca2 + – pumpen til Ca2 + blev signifikant øget, og dette var forbundet med øget intraluminal hjerte sarkoplasmatisk retikulum Ca2+ indhold i de phospholamban-mangelfulde hjerter sammenlignet med vildtype hjerter.21

den funktionelle betydning af phospholamban i reguleringen af hjertekontraktilitet er blevet yderligere underbygget i undersøgelser af phospholamban heterosygøse mus, som kun indeholder en phospholamban-målrettet allel.24 disse Muses hjerter udtrykker 40% af de phospholamban-niveauer, der er til stede i vildtype musehjerter, og denne reducerede phospholamban-ekspression er forbundet med stigninger i affiniteten af det kardiale sarkoplasmatiske retikulum Ca2+ transportsystem for Ca2+ og stigninger i kontraktile parametre. Det er interessant at bemærke, at når niveauerne af phospholamban i vildtype, phospholamban-heterosygøse og phospholamban-mangelfulde hjerter blev afbildet mod sammentræknings-og afslapningshastighederne for disse hjerter, blev der observeret en tæt lineær korrelation (Fig 1), hvilket tyder på en fremtrædende rolle for phospholamban i reguleringen af de basale kontraktile parametre i pattedyrets hjerte. Eftersom niveauerne af det hjertesarkoplasmatiske retikulum Ca2+ ATPase ikke blev påvirket i disse genetisk ændrede hjerter,25 indikerer disse data endvidere, at ændringer i phospholamban-niveauer, som kan afspejle ændringer i den relative støkiometri af phospholamban til det hjertesarkoplasmatiske retikulum Ca2+ ATPase, er forbundet med parallelle ændringer i hjertekontraktile parametre. Imidlertid er den funktionelle støkiometri af phospholamban til det kardiale sarkoplasmatiske retikulum Ca2+ ATPase ikke i øjeblikket kendt. In vitro-studier har rapporteret værdier, der varierer mellem 1: 5 og 5:1 For phospholamban / SERCA2. In vivo-undersøgelser ved anvendelse af transgene mus, som overudtrykker phospholamban specifikt i hjertet, antydede, at den “funktionelle støkiometri” af phospholamban/SERCA2 er mindre end 1:1 i native hjertesarkoplasmatiske retikulummembraner.26 phospholambanproteinniveauerne i hjerterne fra disse transgene mus var dobbelt højere sammenlignet med vildtypehjerter, og den øgede phospholamban-ekspression resulterede i øget inhibering af Ca2+ – ATPase-affiniteten for Ca2+ uden nogen virkning på Vmaks af dette f.eks.26 når de relative niveauer af phospholamban til det kardiale sarkoplasmatiske retikulum Ca2+ ATPase blev afbildet mod EC50-værdierne for Ca2+-ATPase for Ca2+ i phospholamban-overekspression, vildtype, phospholamban-heterosygøse og phospholamban-mangelfulde hjerter, blev der endvidere observeret en tæt lineær korrelation (Fig 2), hvilket indikerer, at den overudtrykte phospholamban i de transgene hjerter var funktionelt koblet til Ca2+ – ATPase. Den nedsatte affinitet af Ca2+-ATPase for Ca2+ i phospholamban-overekspressionshjerterne var forbundet med fald i de kontraktile parametre og depression af Ca2+ – transienterne i isolerede hjertemyocytter sammenlignet med myocytter fra vilde hjerter.26 ekkokardiografiske analyser af hjerter fra disse transgene mus viste signifikant undertrykt fraktioneret forkortelse og periferisk forkortelse sammenlignet med hjerter fra vildtype mus.26 samlet set indikerer disse undersøgelser med genetisk ændrede mus, at phospholamban er en potent repressor af både sammentræknings-og afslapningsparametre i pattedyrets hjerte.

Phospholambans rolle i myokardisk LARP-adrenerg respons

undersøgelser i isolerede bankende hjerter og hjertemyocytter har vist, at administration af catecholamin resulterer i phosphorylering af phospholamban i hjertesarkoplasmatisk retikulum, phospholemman i sarcolemmale membraner og troponin I og C-protein i myofibriller. Satserne for phosphorylering/dephosphoryleringsreaktioner på phospholamban ser imidlertid ud til at være hurtigere end for de andre phosphoproteiner, og phospholamban er blevet foreslået at være en fremtrædende mediator af de LARP-adrenerge reaktioner i pattedyrets hjerte. Phosphorylering af phospholamban, som reaktion på stigninger i cAMP-niveauer under administration af kurr-agonist, ledsages af stigninger i aktiviteten af det kardiale sarkoplasmatiske retikulum Ca2+ transportsystem og øgede hastigheder for hjerteafslapning.272829 de øgede hastigheder på Ca2 + optagelse fører til øgede kardiale sarkoplasmatiske retikulum Ca2+ sekvestreringsniveauer, som er tilgængelige for efterfølgende sammentrækninger, hvilket fører til øget kontraktil kraft. Phospholamban phosphoryleres imidlertid ikke kun af cAMP-afhængig proteinkinase på serin 16, men også af Ca2+-calmodulin proteinkinase på threonin 17,89, og det relative bidrag af hver phosphorylering i de inotrope og lusitropiske virkninger af purpuragonister er ikke i øjeblikket kendt.

den funktionelle rolle af phospholamban i den LARP-adrenerge signalvej er for nylig blevet belyst ved hjælp af den phospholamban-mangelfulde mus. In vitro-undersøgelser i isolerede myocytter og hjertepræparater fra disse mus indikerede signifikant dæmpning af de inotrope og lusitropiske virkninger af isoproterenol sammenlignet med præparater af vildtype.2123 desuden viste in vivo-undersøgelser ved anvendelse af ekkokardiografiske analyser af phospholamban-ablaterede hjerter, at de LARP-adrenerge stimulerende virkninger også blev svækket i det intakte dyr.22 skønt phospholamban således ikke er det eneste protein, der er involveret i transduktion af hjerte-karrus-adrenerg signalering, indikerer det eksperimentelle bevis til dato, at det er en vigtig. Funktionen af phospholamban under catecholaminstimulering af hjertet antyder en rolle for dette protein som en intern “bremsemekanisme”, som muliggør hurtig myokardiereaktion, således at når adrenalin frigives ved en “kamp eller flugt” – situation, lindres phospholamban – “bremsen”, hvilket muliggør hurtige stigninger i hjertesammentrækning og afslapning.

regulering af Phospholamban-ekspression

Phospholamban er produktet af et enkelt gen, og det er blevet klonet fra flere arter, herunder svin, kylling, mus og menneske. Der er >96% homologi mellem kodende regioner af phospholamban-genet blandt disse arter, og der har ikke været nogen isoformer af phospholamban påvist til dato.30 phospholamban-genet er blevet kortlagt til humant kromosom 6.31 undersøgelser i musen har vist, at med hensyn til kredsløbssystemet udtrykkes phospholamban differentielt, lige fra høje niveauer af ekspression i ventrikulær muskel, til mellemniveauer i atriale og pulmonale myocardiale muskler og til lave, men funktionelt signifikante niveauer af ekspression i aorta glat muskel. Differentielle niveauer af phospholamban-ekspression i ventrikulære og atriale rum syntes at korrelere med forskelle i kontraktile parametre for disse muskler.32

Phospholamban-ekspression har også vist sig at være reguleret under udvikling og aldring. Stigninger i phospholamban-ekspression i løbet af hjerteudvikling er blevet observeret hos mus, kylling, rotte og kanin.31323334 desuden er fald i phospholamban-phosphorylering i det aldrende rottehjerte blevet foreslået at være forbundet med formindskede kontraktile reaktioner fra disse hjerter på catecholaminstimulering.33

Myocardial phospholamban-ekspression har også vist sig at være reguleret af skjoldbruskkirtelstatus hos både rotte og kanin.3435 under hypothyroidisme blev phospholamban mRNA-niveauer ikke ændret i kaninatrium og ventrikel, mens phospholamban-proteinniveauer viste sig at stige i rottehjerter. Disse forhøjede niveauer af phospholamban i rottehjerte var forbundet med nedsat hastighed af hjertesarkoplasmatisk retikulum Ca2+ optagelse, i overensstemmelse med øget hæmning af det hjertesarkoplasmatiske retikulum Ca2+ pumpe og nedsat kontraktilitet.34 modsatte regulatoriske virkninger blev observeret for phospholamban-ekspression under hyperthyreoidisme.3435 hyperthyreoidisme var forbundet med nedsatte niveauer af phospholamban-mRNA i kaninatria og ventrikler og nedsatte niveauer af phospholamban-protein i rottehjerter. Faldet i phospholamban niveauer blev afspejlet ved øgede hastigheder af hjerte sarkoplasmatisk retikulum Ca2+ optagelse, i overensstemmelse med disinhibition af Ca2+ pumpen og forbedring af kontraktile parametre.

nylige undersøgelser af ændringer i genekspression, der forekommer under hjertesvigt, indikerede, at ændringer i det relative forhold mellem phospholamban og SR Ca2+ ATPase kan være et kendetegn for denne sygdom.363738 der er imidlertid en vis uoverensstemmelse inden for litteraturen om, hvordan phospholamban-ekspression ændres under myokardieinsufficiens. Nogle undersøgelser udført i svigtende menneskelige hjerter har vist reduktioner i phospholamban mRNA37 eller phospholamban protein,363738 mens andre undersøgelser ikke observerede nogen tilsyneladende ændringer i phospholamban niveauer af svigtende menneskelige hjerter.39404142 selvom der fortsat er kontroverser med hensyn til phospholamban-ændringer under hjertesvigt, er det klart, at intracellulære ændringer, der er forbundet med undertrykkelse af hjertekontraktilitet, antyder en rolle af phospholamban i sygdommens etiologi.

Resume

vores forståelse af phospholambans rolle i hjertefysiologi har udviklet sig i løbet af de sidste to årtier til det punkt, hvor dette protein nu forstås som en kritisk repressor af myokardial kontraktilitet. Phospholamban undertrykker gennem sine hæmmende virkninger på affiniteten af det kardiale sarkoplasmatiske retikulum Ca2+ pumpe til Ca2+ både afslapningshastighederne og sammentrækningen i pattedyrets hjerte. Disse hæmmende virkninger kan lindres gennem (1) phospholamban phosphorylering, (2) nedregulering af phospholamban–genekspression og (3) forstyrrelse af phospholamban-Ca2+ – ATPase-interaktionen. Således kan genetiske tilgange og farmakologiske interventioner, der er designet til at lindre den phospholamban-hæmmende virkning på det kardiale sarkoplasmatiske retikulum Ca2+ – pumpe og myocardial afslapning, vise sig værdifulde til at vende virkningerne af flere sygdomme i pattedyrets hjerte. Sådanne indgreb kunne være designet til at hæmme phospholamban-phosphatasen, stabilisere den phosphorylerede tilstand af phospholamban, afbryde phospholamban-Ca2+ – ATPase-interaktionen, mindske phospholamban-transkription eller forstyrre phospholamban-mRNA-stabilitet. Udvikling af sådanne terapeutiske strategier til at målrette phospholamban vil være et vigtigt fremtidigt mål for den kliniske forbedring af kontraktilitet i det svigtende hjerte.

fodnoter