Rolle af Neisseria meningitidis PorA og PorB-ekspression i antimikrobiel modtagelighed | Company Pride
LETTER
Neisseria meningitidis kan forårsage potentielt dødelig systemisk sygdom. Tidlig diagnose og hurtig antimikrobiel intervention er afgørende for gunstige kliniske resultater. Antibiotikaresistens er rapporteret for penicilliner (1), tetracyclin (2) og sulfonamider (3) samt kinoloner (4) og rifampin (5).
N. meningitidis udtrykker to store poriner, PorA og PorB, som er antigenisk variable mellem stammer og inden for en stamme, og PorA er fasevariabel (tilfældig tænd/sluk-omskiftning) (6). Neisseria gonorrhoeae udtrykker en enkelt porin, PorB. Ændringer i porinekspression eller variant poriner medierer antibiotikaresistens i flere Gram-negative bakterier, herunder N. gonorrhoeae (7,-10). I N. meningitidis øger fraværet af PorB resistens over for tetracyclin og cefsulodin in vitro (11). Poras rolle i antimikrobiel resistens er ikke rapporteret for meningococcus. Ud over sin foreslåede rolle i immununddragelse antog vi, at fasevariabel PorA-ekspression kan give en åbenbar mekanisme for meningococcus at undgå antimikrobielle stoffer, hvis PorA medierer antibiotikaoptagelse eller udelukkelse. Vi genererede stammer mangler PorA eller PorB og gennemført MIC assays. Vi testede også, om ændret PorA-ekspression vælges ved antimikrobiel eksponering i løbet af MIC-analysen.
porA-og porB-generne med flankerende sekvenser blev amplificeret fra N. meningitidis-stammen MC58 og klonet til pGEM T-easy. Invers PCR efterfulgt af selvligering gav plasmider med interne sletninger og indførte restriktionssteder. 12) blev klonet ind i det indførte SmaI-sted for den slettede PorA-allel, hvilket gav plasmid pporalackan. Et chloramphenicolacetyltransferase-gen blev amplificeret og klonet ind i det indførte bglii-sted for den slettede porB-allel i plasmid pPorB:CAT. Kattekonstruktionerne blev omdannet til N. meningitidis-stamme L. 9 (13) for at give stammer L. 9 L. P. og L. 9 L. P. Allelisk udskiftning af vildtype porA-eller porB-alleler med den mutante allel blev bekræftet ved PCR og sekventering såvel som SDS-side af Sarkosyl-ekstraherede ydre membranproteiner (Fig. 1A).
analyse af porinekspression under MIC-analyse. (A) membranproteiner blev isoleret ved Sarkosyl-ekstraktion, og 10 liter blev adskilt på 8 til 12% bis-Tris acrylamidgeler før coomassie-farvning. Bane 1, kors 9; Bane 2, kors 9 kors; Bane 3, kors 9 kors. (B) prøver fra den sidste brønd, der viste uklarhed, blev belagt på BHI-agar og immunoblottet med den PorA-specifikke MAb MN14C11.6.
MIC blev vurderet ved hjælp af bouillonmikrofortyndingsmetode i 96-brøndsplader (14) ved anvendelse af bakterier dyrket natten over på suppleret BHI-agar ved 37 liter C og subkultureret omrystning i ca.4 timer i BHI-bouillon ved 37 liter C før justering til ca. 5 liter 105 CFU / ml baseret på den optiske densitet ved 600 nm (OD600). Efter tilsætning af 50 liter til serielt fortyndede antibiotika blev Mikrofoner registreret efter vækst natten over ved 37 liter C (tabel 1) som de koncentrationer, hvor der ikke blev observeret nogen uklarhed. Hver analyse blev udført tre gange, hver gang i tre eksemplarer. For hver behandling var Mikrofoner identiske inden for og mellem assays.
tabel 1
Mikrofoner for vildtype og mutant N. meningitidis strainsa
| Antibiotikum | MIC (µg/ml) | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| ¢9 | ¢9ΔPorA | ¢9ΔPorB | |||
| Cefotaxime | 0.003125 | 0.003125 | 0.00625 | ||
| Ceftasidime | 0.03125 | 0.03125 | 0.03125 | 0.0625 | |
| Cephalothin | 0.3125 | 0.3125 | 0.3125 | 0.3125 | 0.625 |
| Ampicillin | 0.0625 | 0.0625 | 0.0625 | ||
| Carbenicillin | 0.0625 | 0.0625 | 0.0625 | ||
| 1.25 | 1.25 | 1.25 | 1.25 | ||
| penicillin G | 0.03125 | 0.03125 | 0.03125 | 0.03125 | |
| Piperacillin | 0.03125 | “>0.015625 | |||
| tetracyclin | 0.3125 | 0.3125 | 0.625 | ||
| Doksycyclin | 0.1875 | 0.375 | |||
| 0.003125 | 0.003125 | 0.003125 | 0.00625 | ||
| 1.25 | 1.25 | 1.25 | 1.25 | 1.25 | |
| Imipenem | 0.0625 | 0.0625 | 0.0625 | ||
| Rifampin | |||||
vores resultater bekræftede, at tab af meningokok PorB-ekspression øger modstanden mod tetracyclin (11). Mutationer i PorB bidrager også til resistens over for tetracyclin i N. gonorrhoeae (9, 15). Den anbefalede kombinationsbehandling for multiresistent N. gonorrhoeae omfatter injicerbar ceftriakson og oral doksycyclin eller asithromycin (16). I denne sammenhæng er det bemærkelsesværdigt, at den meningokok-mutante 9-muterede stamme havde nedsat følsomhed over for doksycyclin. Vi bemærkede nedsat modtagelighed for cephalothin for 9.kr. og også for cephalosporinerne cefotaksim og ceftasidim. En tidligere rapport forbandt N. meningitidis PorB-mutation med øget cefsulodinresistens (11). I N. gonorrhoeae, PorB loop 3-varianter bidrager også til forbedret cephalosporinresistens (17). Vores bekræftelse af, at Neisseria PorB modulerer cephalosporinfølsomhed, rejser muligheden for, at reduktion i følsomhed over for denne klasse kan opstå klinisk eller lettes ved mutationer i PorB i enten meningokokker eller gonokokker.anvendelse af Fluorokinolon anbefales ikke længere til gonokokinfektion (18), og punktmutationer i PorB1b af N. gonorrhoeae bidrager til nedsat følsomhed af N. gonorrhoeae over for ciproflocacin. Ekspressionsændringer i gonokokporin ændrer ciprofloksacinresistens (19); vi fandt ud af, at mutation af meningokokporb også resulterer i reduceret ciprofloksacinfølsomhed. Omvendt var denne stamme mere modtagelig for rifampin, det andet store valg til meningokokprofylakse, måske gennem ændret membranarkitektur, som det er blevet foreslået for ændret rifamycinresistens af colistinresistent Acinetobacter baumannii (20).
i modsætning hertil observerede vi ingen ændringer i modtagelighed for porr 9-Porpora sammenlignet med PorA+ – forældrestammen for et hvilket som helst af de testede antibiotika (tabel 1). Dette antyder, at enten PorA ikke har nogen direkte rolle i indtræden af antimikrobielle stoffer i cellen, eller at der er selektion for reduceret PorA-ekspression via fasevariation under MIC-analysen, enten i forældrestammen eller i karrus 9, der potentielt maskerer Pora-medieret antibiotikumindtastning. For at vurdere dette isolerede vi bakterier fra den endelige brønd, hvor turbiditet blev observeret og vurderet PorA-ekspression ved koloniimmunoblotting ved anvendelse af det anti-P1.7 murine monoklonale antistof (MAb) MN14C11.6 (opnået fra NIBSC, Det Forenede Kongerige). Som kontroller, reaktivitet blev sammenlignet mellem forældrestammen Kurt 9 og PorA-mutantstammen Kurt 9 kurtpora. Dette viste, at PorA-ekspression var uændret mellem kontrolbrønde og efter eksponering for et af de testede antimikrobielle stoffer (Se Fig. 1B); således er nedsat modtagelighed af Chr 9 chrporb ikke på grund af ændrede PorA-ekspressionsniveauer.
vores resultater er i overensstemmelse med tidligere rapporter for en rolle for N. meningitidis PorB i cephalosporiner og tetracyclinresistens (9, 11, 15). Parallellerne med gonokok PorB1b med hensyn til antibiotikaresistens er slående. At slå PorB-ekspression ud nedsatte også meningokokfølsomhed over for doksycyclin, en af de anbefalede terapier til multipliceresistent N. gonorrhoeae. Foruroligende antyder dette, at selektivt tryk kan føre til fremkomst af gonokok PorB-varianter med reduceret doksycyklinfølsomhed. Selvom vi kun registrerede 2 gange forskelle, som det ikke er sandsynligt isoleret at føre til behandlingssvigt, synergien af PorB-variation med andre mutationer har potentialet til at udvide meningokok-og gonokokresistensspektret. Vi fandt ingen tegn på en rolle for PorA i antimikrobiel transit over den ydre membran.