een niet-redundante PDB data-set

om de statistische distributies van de glycine en pre-proline Ramachandran plots te extraheren, kozen we voor een high-resolution subset van de PDB die door het Richardson lab geleverd werd met 500 niet-homologe eiwitten. Deze proteã nen hebben een resolutie van beter dan 1.8 Å waar alle waterstofatomen van de backbone zijn geprojecteerd en in termen van verpakking zijn geoptimaliseerd. Na de Richardsons beschouwen we alleen atomen met een B-factor van minder dan 30.

regio ‘ s in de glycine Ramachandran plot

Glycine verschilt fundamenteel van de andere aminozuren omdat het een zij-keten mist. In het bijzonder heeft glycine niet het Cß-atoom, wat veel sterische botsingen veroorzaakt in de generieke plot van Ramachandran. We noemen het waterstofatoom dat gedeeld wordt met de andere aminozuren, het HA1-atoom. We noemen het waterstofatoom dat het Cß-atoom vervangt, het Ha2-atoom. De afwezigheid van het Cß-atoom laat de glycine Ramachandran plot lopen over de grenzen bij -180° en 180° (figuur 1A).

de waargenomen glycine kaart heeft 5 gebieden van dichtheid . Om de waargenomen dichtheid in een continu gebied weer te geven, verschuiven we de coördinaten van φ-ψ naar φ’-ψ’ waarbij φ’: 0° << 360°, en ψ’: -90° <<< 270°. Met de verschoven glycine Ramachandran plot (figuur 3A), kunnen we duidelijk de verschillende regio ‘ s identificeren. Langs de horizontale strook ψ ‘ ~ 180°, zijn er drie afzonderlijke gebieden. Een daarvan is een langgerekte versie van het ßP-gebied van het generieke Ramachandran-perceel. Het ßP-gebied komt overeen met de polyproline II-structuur, die een verlengde linkshandig helix langs de eiwitketen vormt . Het ßPR-gebied is een weerspiegeling van het ßP-gebied waar een opeenvolging van glycineresiduen in de ßPR-bouw een rechtshandige helix zal vormen. Ten slotte is er een regio die overeenkomt met de ßS-regio van het generieke Ramachandran-perceel. Dit gebied komt overeen met de uitgebreide bevleesdheid van residuen in β-bladen. Echter, het glycine ßS gebied, gecentreerd op (φ’, ψ’) = (180°, 180°), is enigszins verplaatst van de ßS – regio van het generieke Ramachandran-perceel. Er zijn ook de diagonale A-en aL-regio ‘ s (Figuur 3A), die worden geassocieerd met helices en bochten . In tegenstelling tot het generieke Ramachandran-perceel is de glycine α-regio symmetrisch met de al-regio . In het generieke Ramachandran-perceel is er ook een γ-gebied dat overeenkomt met de waterstofgebonden γ-draai . De glycine Ramachandran plot heeft geen dichtheid in het γ gebied.

Glycineparameters. (A) de Ramachandran plot in verschoven coördinaten φ’-ψ’. De gestippelde lijnen tonen de sterische botsingen die de grenzen van de waargenomen dichtheden bepalen (figuur 2B beschrijft de specifieke interacties). B) de verdeling van verschillende interatomische interacties als functie van ψ’. De stippellijn toont de limiet van de VDW-diameters. De grijze lijn geeft de modelcurve berekend met ideale geometrie. Onderaan is de frequentieverdeling van de ψ’ hoek. C) frequentieverdeling van de interatomische afstand d(O···H). Er zijn 3 pieken, waarvan de kleinste bij D (O···H) = 2,4 Å, wat overeenkomt met het ßS-gebied.

sterische interacties in glycine

de oorspronkelijke sterische kaart van glycine (figuur 2A) kan grote delen van de waargenomen glycine Ramachandran plot (figuur 1A) niet verklaren. In de waargenomen glycine Ramachandran (figuur 3A) zijn er twee grote uitgesloten horizontale stroken bij 50° << 120° en -120° << -50°, die niet zijn uitgesloten in de glycine sterische kaart (figuur 2a). Omgekeerd sluit de glycinesterische kaart een horizontale strook uit bij -30 ° << 30° (figuur 2A), maar dit gebied wordt in de waargenomen grafiek ingevuld (figuur 1A). Er zijn ook diagonale sterische grenzen in de waargenomen glycine Ramachandran plot (figuur 1A), terwijl de sterische kaart voorspelt verticale grenzen (figuur 2A).

We voerden een herevaluatie uit van de sterische kaart van glycine (figuur 2B) aan de hand van de methodologie van Ho en collega ‘ s . Voor elke interactie in de glycine backbone beschouwen we de variatie van de interatomische afstand ten opzichte van de φ’-ψ’ hoeken. We vergelijken de waargenomen variatie met de variatie gegenereerd uit een model dat canonieke backbone geometrie gebruikt. We verdelen deze interacties in 3 categorieën: De φ ‘afhankelijke, ψ ‘ afhankelijke en φ’-ψ’ co-afhankelijke afstanden.

voor sommige interacties zijn de resultaten voor glycine identiek aan die van de generieke Ramachandran-plot . Om kort te zijn, laten we de analyse van deze interacties weg en vatten we de resultaten samen. De Uitgesloten horizontale strook -30° << 30°, als gevolg van de n···Hi+1 sterische interactie in de glycine sterische kaart (figuur 2A), bestaat niet in de waargenomen verdeling (figuur 1A). Ook het Oi-1···C sterische botsing in de oorspronkelijke glycine sterische kaart, die een verticale strook gecentreerd op φ’ = 0° uitsluit (figuur 2A), bestaat niet in de waargenomen verdeling (figuur 1A). We negeren het effect van de n * * * Hi + 1 en Oi-1···C sterische botsingen. De diagonale grenzen van de waargenomen verdeling worden bepaald door de φ ‘- ψ ‘ co-afhankelijke sterische interacties Oi-1···O en Oi-1···Ni+1. In Figuur 3A laten we zien hoe deze sterische interacties passen bij de data.

hier analyseren we het meest kenmerkende kenmerk van de glycine Ramachandran plot – de neiging voor ψ’ om rond 180° en 0°te clusteren. We richten ons op de ψ’-afhankelijke interacties. Voor elke interactie berekenen we eerst de modelkromme van de corresponderende interatomische afstand als functie van ψ’ (zie methoden). Vervolgens vergelijken we de waargenomen ψ’ – verdeling (onderkant van figuur 3B) met de curve. Als een harde-bolafstoting ψ ‘beperkt, dan, in gebieden van ψ’ waar de modelkromme onder de diameter van Van der Waals (VDW) ligt (horizontale gestreepte lijn in Figuur 3B), moet de ψ’ frequentieverdeling dienovereenkomstig dalen.

In het gebied (60° << 100°) vinden we dat de drop-off in de ψ-frequentieverdeling (onderkant van figuur 3B) overeenkomt met waarden van Ha1···Ni+1 (onderkant van figuur 3B) en Ha2···O (bovenkant van figuur 3B) die kleiner zijn dan hun VDW-diameters. In het gebied (-90° <<<< 270°) komt de drop-off in de ψ-frequentieverdeling overeen met regio ‘ s waar Ha2···Ni+1 en HA1···o zijn te vinden onder hun VDW radii. Daarentegen worden de waarden van Ha1···Hi+1 en Ha2···Hi+1 nooit significant onder hun VDW-diameter gevonden (midden van figuur 3B).

de waargenomen ψ ‘ afhankelijkheid in glycine is te wijten aan de HA1···O, Ha2···O, Ha1···Ni+1 en Ha2···Ni+1 sterische botsingen. Een eenvoudige interpretatie is dat de ψ ‘ afhankelijkheid in glycine voortkomt uit conformaties die ofwel het ni+1 of O atoom tussen de twee Ha atomen plaatsen (figuur 4A). De waargenomen limieten in de verdelingen zijn in Figuur 3A als horizontale lijnen getekend.

Stick figure representation of glycine and pre-proline. (A) glycine in de ψ ~ 180°-bouw waarin het ni+1-atoom tussen de twee Ha-atomen is ingeklemd, en (B) pre-proline in de ζ-bouw waarin het Oi-1-atoom interageert met de Hδ-atomen van de volgende proline.

we verkrijgen zo een herziene sterische kaart van glycine, bestaande uit de sterische botsingen van-1···O, Oi-1···Ni+1, Ha1 * * * O, Ha2· * * O, Ha1 * * * Ni + 1 en Ha2 * * * Ni + 1. Met behulp van parameters uit CHARMM22 berekenen we de potentiële Lennard-Jones 12-6 als gevolg van de herziene sterische botsingen (figuur 5A). Het gebied met minimale energie is verantwoordelijk voor een groot deel van de vorm van de waargenomen verdeling (figuur 3A).

dipool-dipool interacties in glycine. Assen worden getoond in de verschoven φ ‘- ψ ‘ hoeken . Energie plots van (A) De Lennard-Jones 12-6 potentialen van de herziene set van sterische botsingen; (B) Alle elektrostatische interacties; (c)-(f) de individuele dipool-dipool interacties van de glycine backbone (zie figuur 1A voor backbone schema van de dipolen). De energieparameters zijn ontleend aan CHARMM22. De lichtgebieden tonen gebieden met minimale energie.

dipool-dipool interacties in glycine

De herziene glycinesterische kaart verklaart de diagonale vorm van de α -, aL -, ßP -, ßPR-en ßS-regio ‘ s niet. In de generieke Ramachandran plot werd gevonden dat de diagonale vorm van regio ‘ s kon worden gereproduceerd met behulp van elektrostatische dipool-dipool interacties, maar alleen wanneer de dipool-dipool interacties afzonderlijk werden beschouwd. De totale elektrostatische interactie reproduceert de waargenomen Ramachandran-grafiek niet . Hier gebruiken we dezelfde benadering van de behandeling van individuele elektrostatische dipool-dipool interacties langs de glycine backbone.

we berekenen de energiekaart van φ-ψ voor de 4 dipool-dipool interacties in de glycine backbone interactie: COi-1···CO·NH * * * NHi+1, CO * * * NH en COi-1···NHi+1 (Figuur 5C-F). De elektrostatische interacties worden berekend aan de hand van de Lennard-Jones potentialen van de sterische botsingen die in het bovenstaande gedeelte worden geïdentificeerd. We vinden dat de vormen van de verschillende regio ‘ s van de glycine Ramachandran plot (figuur 3A) zijn gereproduceerd (Figuur 5). De co * * * NH-interactie leidt tot de diagonale aL -, α-en β-regio (figuur 5E). De NH * * * NHI+1-interactie produceert ook een diagonaal aL-en α-gebied (figuur 5D). De α-regio is symmetrisch met de aL-regio. De COi-1···CO-interactie levert minima op die overeenkomen met de ßP-en ßPR-regio ‘ s (Figuur 5C).

in de oorspronkelijke glycinesterische kaart (figuur 2A) is het gebied nabij (φ, ψ) = (-180°, 180°) verboden vanwege een sterische botsing tussen O en H. Toch heeft glycine dichtheid in dit gebied in de waargenomen Ramachandran plot (figuur 3A). Dit kan ook worden gezien in de frequentieverdeling van d (O···H) (figuur 3C), waar er een piek is bij D (O···H) ~ 2,4 Å. Op deze piek zijn de O-en H-atomen in contact, omdat de VDW-diameter 2,5 Å is. Zo overwint de gunstige CO···HN dipool-dipool interactie in het ßS-gebied van glycine de sterische afstoting van de O-en H-atomen (figuur 5E).

de pre-proline Ramachandran plot

Schimmel en Flory argumenteerden in 1968 dat pre-proline-aminozuren voorafgaand aan proline-een bijzonder beperkte ramchandran plot heeft, vergeleken met de generieke Ramachandran plot . Dit werd uiteindelijk waargenomen in de eiwitdatabase door MacArthur en Thornton (figuur 1B) .

Er zijn drie belangrijke verschillen tussen de pre-proline Ramachandran plot en de generieke Ramachandran plot. In het pre-proline Ramachandran-perceel is er een grote uitgesloten horizontale strook bij -40° << 50°, die aL-en α-gebieden beperkt. De aL-regio is hoger opgeschoven. Deze twee kenmerken werden gereproduceerd in de Schimmel-Flory berekening en daaropvolgende berekeningen . Het derde kenmerk is een kleine dichtheidspoot die onder het β-gebied uitsteekt (figuur 1B; paars in Figuur 2C). Karplus noemde dit het ζ-gebied, dat uniek is voor pre-proline.

eerdere berekeningen waren niet gericht op de individuele interacties en hielden geen rekening met het ζ-gebied. Hier identificeren we de exacte sterische botsingen die de pre-proline Ramachandran plot bepalen. Vervolgens analyseren we de interacties die verantwoordelijk zijn voor de ζ-regio.

sterische interacties in de pre-proline backbone

in pre-proline, in plaats van een interactie met het NH-atoom in het volgende generieke aminozuur, interageert de pre-proline met een CH2-groep van de volgende proline (figuur 1B). De CH2 groep oefent een veel groter sterisch effect uit op de pre-proline Ramachandran plot. MacArthur en Thornton suggereerden dat het dominante effect te wijten is aan de n···Cδi+1 en cß···Cδi+1 sterische botsingen. Hier kunnen we de effectiviteit van elke botsing analyseren door de statistische distributies direct te analyseren.

We beschouwen de φ-ψ co-afhankelijke interacties waarbij de cδ, Hδ1 en Hδ2 atomen van de volgende proline betrokken zijn (figuur 1B). Voor elke interactie genereren we de contourplot In φ-ψ van de VDW-diameterafstand. Door het vergelijken van de contour plot met de waargenomen dichtheid in de pre-proline Ramachandran plot, identificeren we de interacties die de beste match in de grenzen veroorzaken (figuur 6A, de interacties worden geïdentificeerd in Figuur 2C). We vonden dat het stuk dat uit de onderste linker β-regio van de waargenomen dichtheid wordt genomen, te wijten is aan de Oi-1···Cδi+1 steric clash. Een andere beperking voor de aL-en α-regio ‘ s is te wijten aan de H···Cδi+1 sterische botsing.

we bekijken vervolgens de ψ-afhankelijke interacties. In de pre-proline ψ-frequentieverdeling vonden we drie verschillende pieken (onderste figuur 6B). De meest linkse piek bij ψ ~ -50° komt overeen met het α-gebied van pre-proline. We richten ons op de twee pieken in het β-gebied 50° << 180° de grotere piek gecentreerd op ψ ~ 150° komt overeen met het ßS-gebied van de generieke Ramachandran plot. Op het generieke perceel Ramachandran wordt deze ßS-regio begrensd door de sterische botsingen Cß···O en Cß···Ni+1. In de pre-proline komt de kleinere piek gecentreerd op ψ ~ 70° overeen met het ζ-gebied en vindt plaats in een gebied dat door de cß···o sterische botsing zou worden uitgesloten. In plaats daarvan wordt de kleinere piek van onderaf begrensd door de n···Cδi+1 sterische botsing. Dit kan worden gezien door de ψ-verdeling te vergelijken met de modelcurve van N···Cδi+1 vs.ψ (midden van figuur 6B).

pre-proline parameters. A) het perceel Ramachandran. De gestippelde lijnen tonen de sterische botsingen die enkele grenzen van de waargenomen dichtheden definiëren (zie figuur 2C). B) de verdeling van verschillende interatomische interacties als functie van ψ. De stippellijnen tonen de grens van de VDW-diameters. De effen grijze lijn geeft de modelcurve berekend met ideale geometrie. Onderaan is de frequentieverdeling van de ψ hoek.

met behulp van parameters uit CHARMM22 berekenen we de potentiële Lennard-Jones 12-6 als gevolg van de herziene sterische botsingen (figuur 7A). Het potentieel van Lennard-Jones kan de regio ζ niet verklaren.

energie plots in pre-proline als een functie van φ-ψ. Energie plots van (A) De Lennard-Jones 12-6 potentialen van de herziene set van sterische botsingen; de COi-1···CδHδi+1 dipool-dipool interacties wanneer de volgende proline ring is in (b) De UP pucker en (c) de DOWN pucker. De lichtgebieden tonen gebieden met lage energie.

interacties die de pre-proline ζ-regio stabiliseren

aangezien de ζ-regio (paars in Figuur 2B) de cß···o-interactie in sterisch conflict brengt, moet er een compenserende interactie zijn die de ζ-regio stabiliseert. Wat is deze interactie? Om deze interactie te begrijpen, beschouwen we een analogie met de γ-regio in het generieke Ramachandran-perceel. In het γ-gebied, een vervormde COi-1···HNi + 1 waterstofbinding wordt gevormd, die het Hi + 1 atoom in contact brengt met het Oi-1 atoom. Ook in het ζ-gebied van pre-proline staat het Oi-1-atoom van pre-proline in contact met de hδ1-en Hδ2-atomen (zie figuur 4B; Tabel 1), wat suggereert dat de COi-1-groep samenwerkt met de cδhδi+1-groep van de volgende proline.

kan de cδ Hδi+1 groep interageren met COi-1? Een dergelijke interactie zou vallen onder de klasse van de CH···o zwakke waterstofbinding, een goed gedocumenteerde interactie in eiwitten . Studies van de CH * * * o zwakke waterstofbinding gebruiken een afstandscriterium van d (H···O) < 2,8 Å . Er is weinig hoekafhankelijkheid gevonden in de CH···o-binding rond het H-atoom waar vaak een hoekcriteria van ∠OHX > 90° wordt gebruikt. Dit is veel permissiever dan de geometrie van de canonieke waterstofbinding. In Tabel 1 geven we een overzicht van de waterstofverbindingsparameters van de COi-1···CδHδi+1 interactie in de ζ regio. Aangezien proline twee verschillende belangrijke conformaties kan aannemen, de UP and DOWN pucker, metingen van de geometrie van de COi-1···cδhδi+1 interactie moet ook worden verdeeld in termen van de op en neer pucker. De geobserveerde geometrie van de COi-1···cδhδi + 1 meetkunde voldoet aan de geometrische criteria van de zwakke waterstofbinding (Tabel 1).

als de COi-1···cδhδi + 1 zwakke waterstofbinding is een nauw contact, we moeten de interactie modelleren om de afhankelijkheid van de φ-ψ hoeken te begrijpen. Voor de modellering beschouwen we strategieën die zijn gebruikt voor de analoge COi-1···HNI + 1 waterstofbinding. De COi-1···HNi + 1 waterstofbinding is gemodelleerd in kwantummechanische studies waarbij het γ-gebied de minimale energieconstructie in vacuüm bleek te zijn . Een eenvoudigere benadering, die de waterstofbinding modelleerde met elektrostatische dipool-dipool interacties, vindt ook een minimum in het γ gebied .

hier modelleren we de COi-1···cδhδi + 1 zwakke waterstofbinding als elektrostatische dipool-dipool interactie (zie methoden). Hoe modelleren we de cδhδi+1 groep als een elektrostatische dipool? Bhattacharyya en Chakrabarti ontdekten dat van de CH-groepen in proline, de cδhδ-groep de meeste Ch···o waterstofbindingen vormt. Het Cδ-atoom zit naast het elektron-onttrekkende N-atoom en is dus zuurder dan de andere C-atomen. Bijgevolg plaatsen we een kleine negatieve gedeeltelijke lading op het Cδ-atoom. In ons model vinden we een energieminimum in het ζ-gebied voor zowel de UP pucker (figuur 7B) als de DOWN pucker (figuur 7C). We concluderen dat de COi-1···cδi+1Hδ1i+1 zwakke waterstofbinding stabiliseert het ζ-gebied in pre-proline.