Regulation des kardialen sarkoplasmatischen Retikulums Ca2 + Aufnahme durch Phospholamban

In den frühen 1970er Jahren wurde eine Entdeckung von Arnold Katz (Tada et al1) berichtet, der zeigte, dass die Phosphorylierung isolierter Membranen des kardialen sarkoplasmatischen Retikulums hauptsächlich auf einem Protein mit niedrigem Molekulargewicht erfolgte. Dieses Phosphoprotein wurde Phospholamban genannt, von den griechischen Wurzelwörtern, die „Phosphat erhalten“ bedeuten.“1 Phospholamban ist ein kleines Protein, das 52 Aminosäurereste umfasst und in Herz-, glatten und langsam zuckenden Skelettmuskeln vorhanden ist. Seine regulatorischen Wirkungen wurden jedoch hauptsächlich im Herzmuskel untersucht. In-vitro-Studien zeigten, dass Phospholamat an drei verschiedenen Stellen durch verschiedene Proteinkinasen phosphoryliert werden kann: Serin 10 durch Proteinkinase C; Serin 16 durch cAMP- oder cGMP-abhängige Proteinkinase; und Threonin 17 durch Ca2 + -Calmodulin–abhängige Proteinkinase.23 Jede Phosphorylierung ist mit einer Stimulation der anfänglichen Raten der Ca2 + -Aufnahme des sarkoplasmatischen Retikulums des Herzens verbunden, die hauptsächlich bei niedrigen Werten ausgeprägt ist , was zu einer allgemeinen Erhöhung der Affinität der Ca2 + -Pumpe für Ca2 + führt.45 Auf der Grundlage dieser Beobachtungen wurde zunächst die Hypothese aufgestellt, dass phosphoryliertes Phospholamat als Stimulator des Ca2 + -ATPase (SERCA2) -Enzyms des kardialen sarkoplasmatischen Retikulums wirkt. In den späten 1980er Jahren kam es jedoch zu einem signifikanten Durchbruch, der zeigte, dass dephosphoryliertes Phospholamban tatsächlich ein Inhibitor des Ca2 + -Transports des sarkoplasmatischen Retikulums für Ca2 + ist und dass die Phosphorylierung diesen inhibitorischen Effekt lindert und den Anschein einer phosphorylierungsinduzierten Stimulation erweckt.6 Dieser Befund hat zusammen mit der Identifizierung einer kardialen sarkoplasmatischen Retikulum–assoziierten Proteinphosphatase, die Phospholamban dephosphorylieren kann,7 zu unserem derzeitigen Verständnis von Phospholamban als reversiblem Inhibitor der Ca2 + ATPase-Aktivität des kardialen sarkoplasmatischen Retikulums geführt.

Phospholamban wird auch in situ während der β-adrenergen Stimulation phosphoryliert. Studien an intakten schlagenden Herzen oder isolierten Herzmyozyten haben gezeigt, dass sowohl Serin 16 als auch Threonin 17 in Phospholamban während der Isoproterenolstimulation phosphoryliert werden.89 Es wurde vorgeschlagen, dass die Phosphorylierung von Phospholamban und die damit einhergehenden Erhöhungen der Ca2 + -Aufnahmeraten des kardialen sarkoplasmatischen Retikulums zumindest teilweise für die stimulierenden Wirkungen von β-Agonisten im Säugetierherz verantwortlich sind.

Strukturelle Eigenschaften von Phospholamban

Die Struktur von Phospholamban ist derzeit nicht bekannt, aber basierend auf seiner Aminosäuresequenz wurden mehrere Modelle vorgeschlagen. Es ist allgemein anerkannt, dass es zwei Hauptdomänen gibt: eine hydrophile Domäne (AA 1-30, d.h. Aminosäurereste 1 bis 30), die die drei Phosphorylierungsstellen enthält, und eine hydrophobe Domäne (AA 31-52), die in der kardialen sarkoplasmatischen Retikulummembran verankert ist. Es wurde vorgeschlagen, dass ein Teil der hydrophilen Domäne in einer helikalen Konfiguration vorliegt, und die Phosphorylierung von Phospholamiden kann diese strukturelle Konfiguration abwickeln oder stören.10 Hinweise aus mehreren Laboratorien zeigten die Bedeutung der hydrophilen Domäne bei der Vermittlung der regulatorischen Wirkungen von Phospholamban auf die Ca2 + -Pumpe des kardialen sarkoplasmatischen Retikulums.6111213 Tatsächlich wurde vorgeschlagen, dass AA 2-18 in Phospholamban mit AA 336-412 und 467-762 in SERCA2 zur funktionellen Modifikation interagiert.14

Es wurde auch vorgeschlagen, dass die hydrophobe Domäne von Phospholamiden eine helikale Struktur aufweist. Es gibt derzeit keine eindeutigen Hinweise darauf, dass diese Domäne mit der Ca2 + -Pumpe des kardialen sarkoplasmatischen Retikulums interagiert, obwohl mehrere Studien darauf hingewiesen haben, dass der hydrophobe Teil von Phospholamban auch für die Vermittlung der regulatorischen Wirkungen wichtig ist.1215 Cysteinreste in der α-helikalen Transmembrandomäne sorgen für eine nichtkovalente Wechselwirkung zwischen monomeren Formen und tragen zur Stabilisierung einer pentameren Struktur für Phospholamide bei.16 Die Analyse von Phospholamidpentameren zeigte, dass die Pentamerbildung die eines linkshändigen spiralförmigen Bündels mit einer zylindrischen Ionenpore war.17 Neuere Erkenntnisse haben gezeigt, dass ein Leucin-Reißverschluss die Phospholamidpentamerassoziation stabilisiert und eine zentrale Ionenpore bildet18, die einen Ca2 + -selektiven Ionentransfer ermöglichen kann.19 Derzeit ist jedoch nicht klar, ob die pentamere Assemblierung für die funktionelle Regulation des kardialen sarkoplasmatischen Retikulums Ca2 + ATPase essentiell ist. Expressionsstudien in zellfreien Systemen haben gezeigt, dass die monomeren und pentameren Formen von Phospholamiden bei der Vermittlung der regulatorischen Wirkungen auf die Ca2 + -Pumpe gleichermaßen wirksam sind.14

Eine andere Theorie zur Phospholamban–Ca2+ -ATPase-Wechselwirkung schlug eine dimere Assoziation der Ca2 + -Pumpproteine um ein Phospholamban-Pentamer vor.20 Dieses Modell, basierend auf zeitaufgelöster Phosphoreszenz-Anisotropie, beschrieb eine bevorzugte Wechselwirkung zwischen der Ca2 + -freien Pumpe und dephosphoryliertem Phospholamidat. Die Phospholamban-Phosphorylierung destabilisierte die Wechselwirkung und führte zu einer erhöhten Rotationsmobilität der Ca2 + -ATPase in der kardialen sarkoplasmatischen Retikulummembran.20

Regulation der basalen Myokardkontraktilität durch Phospholamban

Die Rolle von Phospholamban bei der Regulation der basalen Myokardkontraktilität wurde kürzlich durch die Entwicklung einer Phospholamban-defizienten Maus aufgeklärt.21 Diese Mäuse, die mit einer Gen-Targeting-Methode in embryonalen Stammzellen der Maus hergestellt wurden, zeigten eine hyperdynamische Herzfunktion, einschließlich einer erhöhten systolischen Funktion, einer erhöhten linksventrikulären Relaxationsrate,21 und einer verbesserten ventrikulären Füllung.22 Phospholamat-defiziente Herzen entspannten sich nicht nur schneller als Wildtyp-Herzen, sondern zeigten auch verbesserte inotrope Parameter, einschließlich erhöhter Druckentwicklungsraten, die in arbeitsfähigen Präparaten21 und in vivo unter Verwendung echokardiographischer Analysen bewertet wurden.22 Diese Befunde wurden durch In-vitro-Analysen isolierter ventrikulärer Kardiomyozyten aus phospholamidarmen Herzen untermauert, die auch eine Verbesserung der Raten von Relengthening, Verkürzung und Ca2 + -Kinetik zeigten.23 Die verbesserten kontraktilen Parameter spiegelten subzelluläre Veränderungen auf der Ebene des kardialen sarkoplasmatischen Retikulums wider. Die Affinität der Ca2 + -Pumpe zu Ca2 + war signifikant erhöht, und dies war mit einem erhöhten Ca2 + -Gehalt des intraluminalen kardialen sarkoplasmatischen Retikulums in den Phospholamin-defizienten Herzen im Vergleich zu Wildtyp-Herzen verbunden.21

Die funktionelle Bedeutung von Phospholamban bei der Regulation der kardialen Kontraktilität wurde in Studien an heterozygoten Phospholamban-Mäusen, die nur ein auf Phospholamban ausgerichtetes Allel enthalten, weiter belegt.24 Die Herzen dieser Mäuse exprimieren 40% der Phospholamban-Spiegel, die in Wildtyp-Mausherzen vorhanden sind, und diese reduzierte Phospholamban-Expression ist mit einer Erhöhung der Affinität des Ca2 + -Transportsystems des kardialen sarkoplasmatischen Retikulums für Ca2 + und einer Erhöhung der kontraktilen Parameter verbunden. Es ist interessant festzustellen, dass, wenn die Spiegel von Phospholamban in den Wildtyp-, Phospholamban-heterozygoten und Phospholamban-defizienten Herzen gegen die Kontraktions- und Relaxationsraten für diese Herzen aufgetragen wurden, eine enge lineare Korrelation beobachtet wurde (Abb. 1), was auf eine herausragende Rolle von Phospholamban bei der Regulation der basalen Kontraktionsparameter im Säugetierherz hindeutet. Da außerdem die Spiegel des kardialen sarkoplasmatischen Retikulums Ca2 + ATPase in diesen genetisch veränderten Herzen nicht beeinflusst wurden25, deuten diese Daten darauf hin, dass Veränderungen der Phospholambanspiegel, die Veränderungen der relativen Stöchiometrie von Phospholamban zum kardialen sarkoplasmatischen Retikulum Ca2 + ATPase widerspiegeln können, mit parallelen Veränderungen der kardialen Kontraktionsparameter verbunden sind. Die funktionelle Stöchiometrie von Phospholaminen an das kardiale sarkoplasmatische Retikulum Ca2 + ATPase ist derzeit jedoch nicht bekannt. In-vitro-Studien haben Werte zwischen 1:5 und 5 berichtet:1 für Phospholamban/SERCA2. In-vivo-Studien mit transgenen Mäusen, die Phospholamban spezifisch im Herzen überexprimieren, deuteten darauf hin, dass die „funktionelle Stöchiometrie“ von Phospholamban / SERCA2 in nativen kardialen sarkoplasmatischen Retikulummembranen weniger als 1: 1 beträgt.26 Die Phospholamban-Proteinspiegel in den Herzen dieser transgenen Mäuse waren im Vergleich zu Wildtyp-Herzen doppelt so hoch, und die erhöhte Phospholamban-Expression führte zu einer erhöhten Hemmung der Ca2 + -ATPase-Affinität für Ca2 +, ohne Auswirkungen auf die Vmax dieses Enzyms.26 Ferner wurde, als die relativen Spiegel von Phospholamban zur kardialen sarkoplasmatischen Retikulum-Ca2 + -ATPase gegen die EC50-Werte der Ca2 + -ATPase für Ca2 + in Phospholamban-Überexpression, Wildtyp-, Phospholamban-heterozygoten und Phospholamban-defizienten Herzen aufgetragen wurden, eine enge lineare Korrelation beobachtet (Figur 2), was darauf hinweist, dass das überexprimierte Phospholamban in den transgenen Herzen funktionell an die Ca2 + -ATPase gekoppelt war. Die verminderte Affinität der Ca2 + -ATPase für Ca2 + in den Phospholamban-Überexpressionsherzen war mit einer Abnahme der kontraktilen Parameter und einer Depression der Ca2 + -Transienten in isolierten Herzmyozyten im Vergleich zu Myozyten aus Wildtyp-Herzen verbunden.26 Echokardiographische Analysen von Herzen dieser transgenen Mäuse zeigten eine signifikant unterdrückte fraktionierte Verkürzung und Umfangsverkürzung im Vergleich zu Herzen von Wildtyp-Mäusen.26 Zusammengenommen weisen diese Studien an genetisch veränderten Mäusen darauf hin, dass Phospholamban ein starker Repressor sowohl der Kontraktions- als auch der Relaxationsparameter im Säugetierherz ist.

Die Rolle von Phospholamban bei der myokardialen β-adrenergen Reaktionsfähigkeit

Studien an isolierten schlagenden Herzen und Herzmyozyten haben gezeigt, dass die Verabreichung von Katecholamin zu einer Phosphorylierung von Phospholamban im sarkoplasmatischen Retikulum des Herzens, zu Phospholemman in sarkolemmalen Membranen und zu Troponin I- und C-Protein in Myofibrillen führt. Die Raten der Phosphorylierungs- / Dephosphorylierungsreaktionen auf Phospholamban scheinen jedoch schneller zu sein als die der anderen Phosphoproteine, und es wurde vermutet, dass Phospholamban ein prominenter Mediator der β-adrenergen Reaktionen im Säugetierherz ist. Die Phosphorylierung von Phospholamban als Reaktion auf einen Anstieg der cAMP-Spiegel während der Verabreichung von β-Agonisten geht mit einem Anstieg der Aktivität des Ca2 + -Transportsystems des sarkoplasmatischen Retikulums des Herzens und erhöhten Raten der Herzrelaxation einher.272829 Die erhöhten Raten der Ca2 + -Aufnahme führen zu erhöhten Ca2 + -Sequestrierungswerten des sarkoplasmatischen Retikulums des Herzens, die für nachfolgende Kontraktionen verfügbar sind, was zu einer erhöhten Kontraktionskraft führt. Phospholamban wird jedoch nicht nur durch cAMP-abhängige Proteinkinase an Serin 16, sondern auch durch Ca2 + -Calmodulin-Proteinkinase an Threonin 17,89 phosphoryliert, und der relative Beitrag jeder Phosphorylierung zu den inotropen und lusitropen Wirkungen von β-Agonisten ist derzeit nicht bekannt.

Die funktionelle Rolle von Phospholamban im β-adrenergen Signalweg wurde kürzlich anhand der Phospholamban-defizienten Maus aufgeklärt. In-vitro-Studien an isolierten Myozyten und Herzpräparaten dieser Mäuse zeigten eine signifikante Abschwächung der inotropen und lusitropen Wirkungen von Isoproterenol im Vergleich zu Wildtyp-Präparaten.2123 Darüber hinaus zeigten In-vivo-Studien mit echokardiographischen Analysen von phospholamidablierten Herzen, dass die β-adrenergen stimulierenden Wirkungen auch beim intakten Tier abgeschwächt waren.22 Obwohl Phospholamat nicht das einzige Protein ist, das an der Transduktion der kardialen β-adrenergen Signalübertragung beteiligt ist, deuten die bisherigen experimentellen Beweise darauf hin, dass es sich um ein wichtiges Protein handelt. Die Funktion von Phospholamban während der Katecholaminstimulation des Herzens deutet auf eine Rolle dieses Proteins als interner „Bremsmechanismus“ hin, der eine schnelle myokardiale Reaktion ermöglicht, so dass, wenn Adrenalin in einer „Kampf- oder Fluchtsituation“ freigesetzt wird, die Phospholamban „Bremse“ wird gelindert, was eine schnelle Zunahme der Herzkontraktion und -entspannung ermöglicht.

Regulation der Phospholamban-Expression

Phospholamban ist das Produkt eines einzelnen Gens und wurde von mehreren Spezies, einschließlich Schwein, Huhn, Maus und Mensch, kloniert. Es gibt >96% Homologie zwischen kodierenden Regionen des Phospholamban-Gens unter diesen Spezies, und es wurden bisher keine Isoformen von Phospholamban nachgewiesen.30 Das Phospholamban-Gen wurde auf das menschliche Chromosom 6 abgebildet.31 Studien an der Maus haben gezeigt, dass Phospholamat in Bezug auf das Kreislaufsystem differentiell exprimiert wird und von hohen Expressionsniveaus im Ventrikelmuskel über mittlere Expressionsniveaus in atrialen und pulmonalen Myokardmuskeln bis hin zu niedrigen, aber funktionell signifikanten Expressionsniveaus im glatten Aortenmuskel reicht. Unterschiedliche Niveaus der Phospholamidexpression in ventrikulären und atrialen Kompartimenten schienen mit Unterschieden in den kontraktilen Parametern dieser Muskeln zu korrelieren.32

Es wurde auch gezeigt, dass die Expression von Phospholaminen während der Entwicklung und des Alterns reguliert wird. Bei Mäusen, Hühnern, Ratten und Kaninchen wurde eine Zunahme der Phospholamidexpression im Verlauf der Herzentwicklung beobachtet.31323334 Darüber hinaus wurde vorgeschlagen, dass eine Abnahme der Phospholamban-Phosphorylierung im alternden Rattenherz mit verminderten kontraktilen Reaktionen dieser Herzen auf Katecholaminstimulation verbunden ist.33

Es wurde auch gezeigt, dass die myokardiale Phospholamidexpression sowohl bei Ratten als auch bei Kaninchen durch den Schilddrüsenstatus reguliert wird.3435 Während der Hypothyreose wurden die Phospholamban-mRNA-Spiegel im Atrium und Ventrikel des Kaninchens nicht verändert, während die Phospholamban-Proteinspiegel in Rattenherzen anstiegen. Diese erhöhten Phospholamidspiegel im Rattenherz waren mit verringerten Raten der Ca2 + -Aufnahme des sarkoplasmatischen Retikulums des Herzens verbunden, was mit einer erhöhten Hemmung der Ca2 + -Pumpe des sarkoplasmatischen Retikulums des Herzens und einer verringerten Kontraktilität übereinstimmte.34 Entgegengesetzte regulatorische Effekte wurden für die Phospholamidexpression während der Hyperthyreose beobachtet.3435 Hyperthyreose war mit verminderten Spiegeln von Phospholamban-mRNA in Kaninchen-Vorhöfen und Ventrikeln und verringerten Spiegeln von Phospholamban-Protein in Rattenherzen assoziiert. Die Abnahme der Phospholamidspiegel spiegelte sich in erhöhten Raten des kardialen sarkoplasmatischen Retikulums wider Ca2 + Aufnahme, im Einklang mit der Enthemmung der Ca2 + Pumpe und Verbesserung der kontraktilen Parameter.Jüngste Untersuchungen von Veränderungen der Genexpression, die während einer Herzinsuffizienz auftreten, zeigten, dass Veränderungen des relativen Verhältnisses von Phospholamban zur SR-Ca2 + -ATPase ein Kennzeichen dieser Krankheit sein können.363738 Es gibt jedoch einige Diskrepanzen innerhalb der Literatur, wie die Phospholamban-Expression während des Myokardversagens verändert wird. Einige Studien, die an Herzversagen durchgeführt wurden, zeigten eine Verringerung des Phospholamban-mRNA37- oder Phospholamban-Proteins 363738, während in anderen Studien keine offensichtlichen Veränderungen des Phospholamban-Spiegels bei Herzversagen beobachtet wurden.39404142 Obwohl es weiterhin Kontroversen in Bezug auf Phospholamban-Veränderungen während einer Herzinsuffizienz gibt, ist es klar, dass intrazelluläre Veränderungen, die mit einer Unterdrückung der Herzkontraktilität verbunden sind, auf eine Rolle von Phospholamban in der Ätiologie der Krankheit hindeuten.

Zusammenfassung

Unser Verständnis der Rolle von Phospholamiden in der Herzphysiologie hat sich in den letzten zwei Jahrzehnten so weit entwickelt, dass dieses Protein heute als kritischer Repressor der myokardialen Kontraktilität angesehen wird. Phospholamban unterdrückt durch seine hemmenden Wirkungen auf die Affinität der Ca2 + -Pumpe des kardialen sarkoplasmatischen Retikulums für Ca2 + sowohl die Entspannungs- als auch die Kontraktionsraten im Säugetierherz. Diese inhibitorischen Effekte können durch (1) Phospholamban–Phosphorylierung, (2) Herunterregulierung der Phospholamban-Genexpression und (3) Störung der Phospholamban-Ca2 + -ATPase-Interaktion gelindert werden. Somit, Genetische Ansätze und pharmakologische Interventionen, entwickelt, um die phospholamidinhibitorische Wirkung auf die Ca2 + -Pumpe des kardialen sarkoplasmatischen Retikulums und die Myokardrelaxation zu lindern, kann sich bei der Umkehrung der Auswirkungen mehrerer Krankheiten im Säugetierherz als wertvoll erweisen. Solche Interventionen könnten entwickelt werden, um die Phospholamban-Phosphatase zu hemmen, den phosphorylierten Zustand von Phospholamban zu stabilisieren, die Phospholamban-Ca2 + -ATPase-Interaktion zu unterbrechen, die Phospholamban-Transkription zu verringern oder die Phospholamban-mRNA-Stabilität zu stören. Die Entwicklung solcher Therapiestrategien gegen Phospholamide wird ein wichtiges zukünftiges Ziel für die klinische Verbesserung der Kontraktilität bei Herzinsuffizienz sein.

Fußnoten