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Neisseria meningitidis kann potenziell tödliche systemische Erkrankungen verursachen. Eine frühzeitige Diagnose und eine schnelle antimikrobielle Intervention sind entscheidend für günstige klinische Ergebnisse. Antibiotikaresistenzen wurden für Penicilline (1), Tetracyclin (2) und Sulfonamide (3) sowie Chinolone (4) und Rifampicin (5) berichtet.

N. meningitidis exprimiert zwei Hauptporine, PorA und PorB, die zwischen Stämmen und innerhalb eines Stammes antigenisch variabel sind, und PorA ist phasenvariabel (zufälliges Ein- / Ausschalten) (6). Neisseria gonorrhoeae exprimiert ein einzelnes Porin, PorB. Veränderungen der Porinexpression oder Variantenporine vermitteln Antibiotikaresistenz bei mehreren gramnegativen Bakterien, einschließlich N. gonorrhoeae (7,-10). Bei N. meningitidis erhöht das Fehlen von PorB die Resistenz gegen Tetracyclin und Cefsulodin in vitro (11). Die Rolle von PorA bei der antimikrobiellen Resistenz wurde für Meningokokken nicht berichtet. Zusätzlich zu seiner vorgeschlagenen Rolle bei der Immunevasion stellten wir die Hypothese auf, dass die phasenvariable PorA-Expression einen offensichtlichen Mechanismus für den Meningokokken darstellt, um antimikrobiellen Mitteln auszuweichen, wenn PorA die Aufnahme oder den Ausschluss von Antibiotika vermittelt. Wir generierten Stämme ohne PorA oder PorB und führten MHK-Assays durch. Wir testeten auch, ob die veränderte PorA-Expression durch antimikrobielle Exposition im Verlauf des MHK-Assays selektiert wird.

Die Gene porA und porB mit flankierenden Sequenzen wurden aus N. meningitidis Stamm MC58 amplifiziert und in pGEM T-easy kloniert. Inverse PCR gefolgt von Selbstligierung ergab Plasmide mit internen Deletionen und eingeführten Restriktionsstellen. Die lacZ/Kanamycin-Kassette (12) wurde in die eingeführte SmaI-Stelle des deletierten PorA-Allels kloniert, wobei Plasmid pPorALacZKan erhalten wurde. Ein Chloramphenicolacetyltransferase-Gen wurde amplifiziert und in die eingeführte BglII-Stelle des deletierten porB-Allels kloniert, in Plasmid pPorB:CAT. Die Pora lacZ kan- oder porB::cat-Konstrukte wurden in N. meningitidis-Stamm ¢9 (13) transformiert, um Stämme ¢9ΔPorA und ¢9ΔPorB zu erhalten. Der allelische Ersatz von Wildtyp-porA- oder porB-Allelen durch das mutierte Allel wurde durch PCR und Sequenzierung sowie SDS-PAGE von Sarkosyl-extrahierten äußeren Membranproteinen bestätigt (Abb. 1A).

Analyse der Porinexpression während der MHK-Analyse. (A) Membranproteine wurden durch Sarkosylextraktion isoliert und 10 µg wurden vor der Coomassie-Färbung auf 8 bis 12% ige Bis-Trisacrylamidgele aufgetrennt. Spur 1, ¢9; Spur 2, ¢9ΔPorA; Spur 3, ¢9ΔPorB. (B) Proben aus der letzten Vertiefung, die Trübung zeigten, wurden auf BHI-Agar plattiert und mit dem PorA-spezifischen MAb MN14C11.6 immunblottet.

Die MHK wurden mittels Bouillon-Mikrodilutionsmethode in 96-Well-Platten (14) unter Verwendung von Bakterien beurteilt, die über Nacht auf supplementiertem BHI-Agar bei 37 ° C gezüchtet und etwa 4 h in BHI-Brühe bei 37 ° C subkultiviert wurden, bevor sie auf etwa 5 × 105 KBE / ml basierend auf der optischen Dichte bei 600 nm (OD600) eingestellt wurden. Nach Zugabe von 50 µl zu seriell verdünnten Antibiotika wurden MICs nach Wachstum über Nacht bei 37 °C aufgezeichnet (Tabelle 1) als die Konzentrationen, bei denen keine Trübung beobachtet wurde. Jeder Test wurde dreimal durchgeführt, jedes Mal in dreifacher Ausfertigung. Für jede Behandlung waren die Mikrofone innerhalb und zwischen den Assays identisch.

Unsere Ergebnisse bestätigten, dass der Verlust der Meningokokken-PorB-Expression die Resistenz gegen Tetracyclin erhöht (11). Mutationen in PorB tragen auch zur Resistenz gegen Tetracyclin in N bei. gonorrhoeae (9, 15). Die empfohlene Kombinationstherapie für mehrfach resistente N. gonorrhoeae umfasst injizierbares Ceftriaxon und orales Doxycyclin oder Azithromycin (16). In diesem Zusammenhang ist bemerkenswert, dass der Meningokokken ¢ 9ΔPorB-Mutantenstamm eine verringerte Empfindlichkeit gegenüber Doxycyclin aufwies. Wir bemerkten eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber Cephalothin für ¢ 9ΔPorB und auch für die Cephalosporine Cefotaxim und Ceftazidim. Ein früherer Bericht verband die N. meningitidis PorB-Mutation mit einer erhöhten Cefsulodin-Resistenz (11). In N. gonorrhoeae, PorB-3-Varianten tragen ebenfalls zu einer erhöhten Cephalosporinresistenz bei (17). Unsere Bestätigung, dass Neisseria PorB die Cephalosporin-Empfindlichkeit moduliert, wirft die Möglichkeit auf, dass eine Verringerung der Empfindlichkeit gegenüber dieser Klasse klinisch auftreten oder durch Mutationen in PorB entweder bei Meningokokken oder Gonokokken erleichtert werden kann.

Die Verwendung von Fluorchinolon wird bei Gonokokkeninfektionen nicht mehr empfohlen (18), und Punktmutationen in PorB1b von N. gonorrhoeae tragen zu einer verringerten Empfindlichkeit von N. gonorrhoeae gegenüber Ciprofloxacin bei. Expressionsänderungen in Gonokokken-Porin verändern die Ciprofloxacin-Resistenz (19); Wir fanden heraus, dass die Mutation von Meningokokken-PorB auch zu einer verringerten Ciprofloxacin-Empfindlichkeit führt. Umgekehrt war dieser Stamm anfälliger für Rifampicin, die andere wichtige Wahl für die Meningokokkenprophylaxe, möglicherweise durch veränderte Membranarchitektur, wie für eine veränderte Rifamycinresistenz von Colistin-resistentem Acinetobacter baumannii vorgeschlagen wurde (20).

Im Gegensatz dazu beobachteten wir keine Veränderungen der Empfindlichkeit von ¢9ΔPorA im Vergleich zum PorA + -Mutterstamm für eines der getesteten Antibiotika (Tabelle 1). Dies deutet darauf hin, dass PorA entweder keine direkte Rolle beim Eintritt von antimikrobiellen Wirkstoffen in die Zelle spielt oder dass es eine Selektion für eine reduzierte PorA-Expression über Phasenvariation während des MHK-Assays gibt, entweder im elterlichen Stamm oder in ¢ 9ΔPorB, wodurch möglicherweise der PorA-vermittelte Antibiotikaeintritt maskiert wird. Um dies zu beurteilen, isolierten wir Bakterien aus der letzten Vertiefung, in der Trübung beobachtet wurde, und bewerteten die PorA-Expression durch Kolonie-Immunoblotting unter Verwendung des anti-P1.7 murinen monoklonalen Antikörpers (MAb) MN14C11.6 (erhalten von NIBSC, Vereinigtes Königreich). Als Kontrollen wurde die Reaktivität zwischen dem Elternstamm ¢9 und dem PorA-Mutantenstamm ¢9ΔPorA verglichen. Dies zeigte, dass die PorA-Expression zwischen Kontrollbrunnen und nach Exposition gegenüber einem der getesteten antimikrobiellen Mittel unverändert war (siehe Abb. 1B); Somit ist eine verminderte Suszeptibilität von ¢ 9ΔPorB nicht auf veränderte PorA-Expressionsniveaus zurückzuführen.

Unsere Ergebnisse stimmen mit früheren Berichten über eine Rolle von N. meningitidis PorB bei Cephalosporinen und Tetracyclinresistenz überein (9, 11, 15). Die Parallelen zu Gonokokken PorB1b in Bezug auf Antibiotikaresistenzen sind auffällig. Das Ausschlagen der PorB-Expression verringerte auch die Meningokokken-Empfindlichkeit gegenüber Doxycyclin, einer der empfohlenen Therapien für mehrfach resistente N. gonorrhoeae. Beunruhigenderweise deutet dies darauf hin, dass selektiver Druck zum Auftreten von Gonokokken-PorB-Varianten mit reduzierter Doxycyclin-Empfindlichkeit führen kann. Obwohl wir nur 2-fache Unterschiede verzeichneten, die isoliert wahrscheinlich nicht zu Behandlungsfehlern führen, hat die Synergie der PorB-Variation mit anderen Mutationen das Potenzial, das Meningokokken- und Gonokokken-Resistenzspektrum zu erweitern. Wir fanden keine Hinweise auf eine Rolle von PorA beim antimikrobiellen Transit durch die äußere Membran.