Robert De Niro Sr. wurde in Syracuse, New York, als Sohn einer irisch-amerikanischen Mutter, Helen M. (née O’Reilly; 1899-1999), geboren. Helens Mutter war Mary E. Burns (geboren als Tochter von John und Mary Burns) und ihr Vater war Dennis Francis O’Reilly, geboren als Tochter von Dundrums Ellen Hall, der zweiten Frau von Edward O’Reilly. Es gab vorherige Verwirrung über Dennis’Mutterschaft, seine Mutter dachte zuvor Edwards zweite Frau Margaret zu sein.Roberts italienisch-amerikanischer Vater, Henry Martin De Niro (1897-1976), wurde als Sohn von Eltern geboren, die 1887 aus Ferrazzano ausgewandert waren, Angelina Mercurio und Giovanni Di Niro.Robert war das älteste von drei Kindern; er und die Geschwister John und Joan wurden in Syracuse, New York, erzogen. De Niro studierte von 1939 bis 1940 am renommierten Black Mountain College bei Josef Albers. Während Albers ‚hochanalytischer Zugang zur Malerei nicht zu De Niros instinktiverem Stil passte, hinterließen die Erfahrung und die internationale Perspektive des Bauhausmeisters dennoch einen bleibenden Eindruck. De Niro studierte bei Hans Hofmann an seiner Sommerschule in Provincetown, Massachusetts. Hofmanns Lehre über abstrakten Expressionismus und kubistischen Formalismus hatte einen starken Einfluss auf De Niros Entwicklung als reifer Künstler.

An Hofmanns Sommerschule lernte er seine Kommilitonin Virginia Admiral kennen, die er 1942 heiratete. Das Paar zog in ein großes, luftiges Loft im New Yorker Greenwich Village, wo sie malen konnten. Sie umgaben sich mit einem illustren Freundeskreis, darunter die Schriftsteller Anaïs Nin und Henry Miller, der Dramatiker Tennessee Williams und die Schauspielerin und berühmte Berliner Tänzerin Valeska Gert. Admiral und De Niro trennten sich kurz nach der Geburt ihres Sohnes Robert De Niro Jr. im August 1943, nachdem De Niro sich als schwul herausgestellt hatte. 1944 hatte De Niro eine Beziehung mit dem Dichter Robert Duncan.Nach einem Studium bei Hans Hofmann in New York und Provincetown und Josef Albers am Black Mountain College, North Carolina in den späten 1930er und frühen 1940er Jahren arbeitete De Niro fünf Jahre lang in Hilla Rebays legendärem Museum of Non-Objective Art. 1945 wurde er in eine Gruppenausstellung in Peggy Guggenheims Art of This Century in New York aufgenommen, einer führenden Galerie für die Kunst etablierter europäischer Modernisten und Mitglieder der aufstrebenden Gruppe des abstrakten Expressionismus wie Jackson Pollock, Mark Rothko, Robert Motherwell und Clyfford Still. De Niro hatte seine erste Einzelausstellung in Guggenheims Galerie im April und Mai des folgenden Jahres. Zu diesem Zeitpunkt arbeitete er vor allem abstrakt, oft mit figürlichen Bezügen. Ein Großteil seiner Arbeiten aus dieser Zeit ging 1949 bei einem Atelierbrand verloren.De Niro hatte in den 1950er Jahren eine Reihe von Einzelausstellungen in der Charles Egan Gallery in New York, die die Werke von Willem de Kooning und anderen frühen Künstlern des abstrakten Expressionismus ausstellten. Kritiker lobten Deniros Kompositionen, die mit improvisierten Bereichen lebendiger Farben gefüllt waren, die locker gemalten Stillleben und kurvenreichen Akten Platz machten. Mitte der 1950er Jahre wurde De Niro regelmäßig in wichtige Gruppenausstellungen wie das Whitney Annual, das Stable Annual und das Jewish Museum aufgenommen. 1958 erhielt er den Longview Foundation Award.

Robert De Niros „Blumen in einer blauen Vase“, 1966.

Von 1961 bis 1964 reiste De Niro nach Frankreich, um in Paris und in der umliegenden Landschaft zu malen. Der Sammler Joseph Hirshhorn erwarb in dieser Zeit über De Niros Galeristin Virginia Zabriskie eine Reihe von Gemälden und Papierarbeiten des Künstlers, die sich heute in der ständigen Sammlung des Hirshhorn Museum and Sculpture Garden in Washington, DC, befinden. 1968 erhielt er ein Guggenheim-Stipendium.