Methodische Aspekte

Streptozotocin (2-desoxy-2-(3-methyl-3-nitrosoureido) -d-glucopyranose), ein Antibiotikum mit antineoplastischer Wirkung, das von Streptomyces achromogenes-Bakterien produziert wird, zerstört selektiv die β-Zellen der Langerhans-Pankreasinseln (Abb. 9.1).11 Streptozotocin induziert DNA-Strangbrüche und DNA-Alkylierung, was zu Nekrose von Pankreas-β-Zellen führt.12,13 Streptozotocin wird innerhalb der β-Zelle durch den Glukosetransporter GLUT2 transportiert, und die Expression von GLUT2 ist daher für die toxische Wirkung erforderlich.13,14 Die Signalwege der toxischen Wirkung von Streptozotocin beinhalten die Aktivierung der induzierbaren NO-Synthase, die Erhöhung der NO-Konzentration,15 und eine erhöhte H2O2-Erzeugung.16

ABBILDUNG 9.1. Histologie und Immunhistochemie der Pankreasinseln von Langerhans bei Kontroll- (linkes Panel) und Streptozotocin-induzierten diabetischen (rechtes Panel) Ratten.

Bei diabetischen Ratten war die Anzahl und Größe der Inseln verringert und die Immunreaktivität für Insulin verringert.

Die Entwicklung von Diabetes mellitus nach der Anwendung von Streptozotocin ist sehr schnell, besonders bei der Ratte. Die Empfindlichkeit von β-Zellen gegenüber Glucose ist bereits 2 Stunden nach der Anwendung von Streptozotocin signifikant reduziert; Die Zerstörung und signifikante Reduktion der Anzahl von β-Zellen erfolgt mehrere Stunden nach der Anwendung.17 Dies wird von Veränderungen der Glukose- und Insulinplasmaspiegel begleitet: 2 Stunden nach der Anwendung entwickelt sich eine Hyperglykämie ohne Veränderungen des Plasma- und Pankreasinsulinspiegels, gefolgt von einer Hypoglykämie mit erhöhten Insulinplasmaspiegeln, jedoch ohne Veränderung des Pankreasinsulinspiegels. Einen Tag nach der Anwendung von Streptozotocin zeigen die Ratten alle charakteristischen Symptome von Diabetes, einschließlich Hyperglykämie, Glykosurie, Polyurie und reduzierten Plasma- und Pankreasinsulinspiegeln.18

Streptozotocin kann in einer Einzeldosis oder wiederholt angewendet werden, üblicherweise gelöst in Citratpuffer (pH 4.5), durch intravenöse, intraperitoneale oder intraarterielle Injektion. In unseren Experimenten wurde Diabetes zuverlässig durch eine einzige intravenöse Injektion von Streptozotocin, gelöst in Citratpuffer in der Schwanzvene, in einer Dosis von 65 mg / kg Körpergewicht induziert. Die für die Diabetesinduktion bei Ratten erforderliche Dosis variiert zwischen 40 und 60 mg / kg Körpergewicht, obwohl manchmal höhere Werte berichtet werden.19 Die diabetischen Symptome korrelieren gut mit der verwendeten Dosis. Im Allgemeinen werden bei Dosen unter 40 mg/kg Körpergewicht nur geringfügige Änderungen der Glykämie-, Glykosurie- und Insulinplasmaspiegel beobachtet, und diese geringfügigen Änderungen neigen dazu, sich bei bis zu 25% der Tiere spontan zu normalisieren.18 Mit einer ausreichenden Dosis Streptozotocin ist die Induktion von Diabetes bei Ratten einfach, schnell und zuverlässig. In den meisten Studien mit diesem Rattenmodell wurden die Pathogenese von Diabetes und die damit verbundenen Symptome jedoch nur für mehrere Wochen oder Monate untersucht, in denen Diabetes vollständig entwickelt und aufrechterhalten wird. Die Langzeitwirkungen von Streptozotocin und eine mögliche Erholung von Streptozotocin-induziertem Diabetes wurden viel weniger untersucht.

In unseren Experimenten verfolgten wir Ratten mit Streptozotocin-induziertem Diabetes 1 Jahr lang, und bei einem signifikanten Anteil der Tiere wurde eine Erholung beobachtet. Alle 152 Ratten zeigten in den ersten 6 Monaten des Experiments einen ausgewachsenen Diabetes; In der zweiten Jahreshälfte konnten zwei verschiedene Gruppen deutlich unterschieden werden. In der diabetischen Gruppe (n = 92) blieb die Glykämie hoch (> 18 mmol/L), das Körpergewicht stieg nicht an, die Plasmaspiegel von Insulin wurden niedrig gehalten und die histologische Analyse ergab eine Verringerung der Anzahl und Größe der Pankreasinseln mit einem Mangel an insulinsekretierenden Zellen. Im Gegensatz dazu zeigte die Erholungsgruppe (n = 60) in der zweiten Jahreshälfte signifikante Unterschiede, die in den ersten 6 Monaten des Experiments nicht vorhanden waren: niedrigere Glykämie (< 12 mmol/l), stetig zunehmendes Körpergewicht und höhere Plasmaspiegel von Insulin, die sich den Werten von Kontrolltieren näherten. Auch die histologische Struktur der Pankreasinseln ähnelte der von Kontrolltieren mit einer Anzahl gut erhaltener β-Zellen. Daher gab es nach 6 Monaten eine signifikante Gruppe von Tieren (∼ 40%), die eine signifikante Erholung zeigten, wobei sich eine Reihe von Parametern den Werten näherte, die bei nicht-diabetischen Kontrolltieren beobachtet wurden. Der einzige Test, der die Erholungstiere zuverlässig von nicht-diabetischen Kontrollen unterscheiden konnte, war der Glukosetoleranztest. Der Glukosetoleranztest wurde im 9. und 12. Monat des Experiments durchgeführt, und die Kurve für die Erholungstiere zeigte deutlich pathologische Werte, die der diabetischen Gruppe ähnlich waren und sich signifikant von denen der nicht-diabetischen Kontrolltiere unterschieden. Beide Streptozotocingruppen reagierten mit einer verminderten Insulinsekretion. Zusammenfassend war der Streptozotocin-induzierte Diabetes mellitus bei Ratten 6 Monate lang stabil; danach entwickelte sich jedoch bei ∼ 40% Tieren eine signifikante Erholung. Die funktionelle Insuffizienz der Erholung in diesem Zeitraum (7-12 Monate nach Streptozotocin-Anwendung) kann durch den Glukosetoleranztest aufgedeckt werden. Die Insulinsekretion bei den Tieren ist in Ruhe wahrscheinlich ausreichend; eine erhöhte Glukosebelastung entlarvt jedoch die noch eingeschränkte Glukosetoleranz. Bei der Mehrzahl der Tiere (∼ 60%) wurde keine Erholung beobachtet und schwerer Diabetes hielt über den Zeitraum von 12 Monaten an. Eine spontane Erholung von Streptozotocin-induziertem Diabetes wurde bereits bei neugeborenen Ratten beschrieben, bei denen Streptozotocin bei der Geburt angewendet wurde,20 und bei erwachsenen Tieren, jedoch mit niedrig dosiertem Streptozotocin.21,22

Streptozotocin wird neben der Ratte auch zur Induktion von Diabetes bei anderen Arten verwendet. Bei Mäusen kann Typ-I-Diabetes entweder durch eine einzelne höhere Dosis Streptozotocin oder durch wiederholte Anwendung niedrigerer Dosen induziert werden, die beide intraperitoneal angewendet werden. Bei Einzeldosisanwendung wird eine zuverlässige Induktion für Dosen von 200 mg / kg beschrieben.23,24 Ein schwerwiegender Nachteil der Einzeldosisanwendung ist die sehr hohe sofortige Letalität (bis zu 90% für 180 mg / kg in unseren Händen). Die wiederholte Anwendung von Streptozotocin wird normalerweise mit Dosen von 40-50 mg / kg täglich an 5 aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt.25 Die charakteristischen diabetischen Symptome (Hyperglykämie, Glykosurie, stagnierendes Körpergewicht) entwickeln sich nach Anwendung der letzten Dosis. Die Mäuse zeigen typischerweise signifikante Unterschiede zwischen den Geschlechtern: Bei männlichen Mäusen waren die Plasmaspiegel von Glucose nach Streptozotocin-Applikation signifikant höher als bei weiblichen Mäusen. Da bekannt ist, dass die Verabreichung von Testosteron die hyperglykämische Reaktion bei kastrierten Männern und Frauen sowie bei nicht kastrierten Frauen erhöht, trägt es wahrscheinlich zu den diabetogenen Wirkungen von Streptozotocin bei.26

Die Ergebnisse beim Meerschweinchen sind umstritten. Nach einigen Studien sind Meerschweinchen resistent gegen die diabetogenen Wirkungen von Streptozotocin.27 Im Gegensatz dazu beschreiben andere Studien ein zuverlässiges Meerschweinchenmodell für Streptozotocin-induzierten Diabetes auf der Grundlage von reduzierter Wachstumsrate, β-Zelldysfunktion, Polydipsie, Polyurie und Glykosurie.28 Unterschiede in den experimentellen Methoden der Diabetesinduktion, insbesondere Dosierung und Anwendung, können für diese Diskrepanzen verantwortlich sein. Die am meisten empfohlenen Methoden umfassen die intrakardiale Anwendung von Streptozotocin (200 mg / kg) vor Insulinverabreichung,29 die intrakardiale Injektion von Streptozotocin (150 mg / kg) ohne Insulin, 28 oder die intravenöse Anwendung von Streptozotocin.30 Aufgrund der Unterschiede in der Methode der Diabetesinduktion unterscheiden sich auch die diabetischen Parameter, der zeitliche Verlauf der Erkrankung und die damit verbundene Letalität zwischen den Modellen. Während die intraperitoneale Anwendung von Streptozotocin (300 mg/kg) unter unseren Versuchsbedingungen keine diabetischen Symptome hervorrief, führte die intravenöse Verabreichung von Streptozotocin (150 mg/kg) zu einer signifikanten Glykosurie. Die histologische Analyse der Bauchspeicheldrüse zeigte keine Anzeichen einer Zerstörung der Inseln, unabhängig von der Art der Streptozotocin-Verabreichung. Selbst die nach intravenöser Verabreichung von Streptozotocin beobachtete Glykosurie ist möglicherweise nicht das diabetische Symptom, sondern das Ergebnis einer direkten nephrotoxischen Wirkung von Streptozotocin, die bei Patienten beschrieben wurde. Diese Hypothese wird durch die Tatsache gestützt, dass eine tägliche Verabreichung von Insulin (5 ie / kg) die Glykosurie nicht verhinderte.

Im Hinblick auf das Kaninchenmodell des Diabetes überwiegen Studien mit dem Alloxan-induzierten Modell eindeutig. Studien mit Streptozotocin-induziertem Diabetes am Kaninchen sind selten und widersprüchlich. Es gibt einige Hinweise auf diabetogene Wirkungen von Streptozotocin bei erwachsenen Kaninchen sowie Feten, aber andere Studien sprechen gegen diese Möglichkeit.27,31-34

Bei großen Säugetieren wurde Streptozotocin erfolgreich zur Induktion von Diabetes bei Hunden und Schweinen eingesetzt. Beim Hund war die Anwendung von Streptozotocin mit einer hohen Mortalität verbunden, und daher wurden mehrere Techniken entwickelt, um die Dosis von Streptozotocin und die damit verbundene Mortalität zu reduzieren. In: Freyse et al.35 kombinierte partielle Pankreatektomie und niedrig dosierte (2 mg / kg) Streptozotocin-Infusion in die Arteria Pancreaticoduodenalis superior. Andere Techniken umfassen eine kombinierte intravenöse Verabreichung von Streptozotocin und Alloxan und eine suprarenale intraarterielle Infusion von Streptozotocin und Alloxan nach Ballonverschluss der juxtarenalen Bauchaorta.36,37 Eine weitere große Säugetierart, die empfindlich auf die diabetogenen Wirkungen von Streptozotocin reagiert, ist das Schwein (und Minipig). Für eine zuverlässige diabetogene Wirkung von Streptozotocin sowohl bei Schweinen als auch bei Minischweinen wird eine Dosis von 100-150 mg / kg benötigt.38 Bei Minipigs wurde auch über eine erfolgreiche Induktion von Diabetes durch zwei niedrige Dosen (40 mg/kg) berichtet.39