Aspectos metodológicos

Estreptozotocina (2-desoxi-2-(3-metil-3-nitrosoureido)-d-glucopiranosa), un antibiótico con efectos antineoplásicos producido por la bacteria Streptomyces achromogenes, destruye selectivamente las células β de los islotes pancreáticos de Langerhans (Fig. 9.1).11 La estreptozotocina induce roturas de cadenas de ADN y alquilación de ADN, lo que conduce a la necrosis de las células β pancreáticas.La estreptozotocina 12,13 es transportada dentro de la célula β por el transportador de glucosa GLUT2, y por lo tanto se requiere la expresión de GLUT2 para el efecto tóxico.13,14 Las vías de señalización del efecto tóxico de la estreptozotocina implican la activación de la NO-sintasa inducible, el aumento de la concentración de NO15 y el aumento de la generación de H2O2.16

la FIGURA 9.1. Histología e inmunohistoquímica de los islotes pancreáticos de Langerhans en control (panel izquierdo) y ratas diabéticas inducidas por estreptozotocina (panel derecho).

En ratas diabéticas, se redujo el número y el tamaño de los islotes y se redujo la inmunorreactividad para la insulina.

El desarrollo de diabetes mellitus después de la aplicación de estreptozotocina es muy rápido, especialmente en la rata. La sensibilidad de las células β a la glucosa ya se reduce significativamente 2 horas después de la aplicación de estreptozotocina; la destrucción y la reducción significativa del número de células β se producen varias horas después de la aplicación.17 Esto va acompañado de cambios en los niveles plasmáticos de glucosa e insulina: 2 horas después de la aplicación, se desarrolla una hiperglucemia sin cambios en los niveles de insulina pancreática y plasmática, seguida de hipoglucemia con niveles plasmáticos aumentados de insulina, pero sin cambios en el nivel de insulina pancreática. Un día después de la aplicación de estreptozotocina, las ratas muestran todos los síntomas característicos de la diabetes, incluyendo hiperglucemia, glucosuria, poliuria y niveles reducidos de insulina en plasma y páncreas.18

La estreptozotocina se puede aplicar en una sola dosis o de forma repetida, generalmente disuelta en tampón de citrato (pH 4.5), por inyección intravenosa, intraperitoneal o intrarterial. En nuestros experimentos, la diabetes fue inducida de manera confiable por una sola inyección intravenosa de estreptozotocina disuelta en tampón de citrato en la vena de la cola, a una dosis de 65 mg/kg de peso corporal. La dosis necesaria para la inducción de la diabetes en ratas varía entre 40 y 60 mg/kg de peso corporal, aunque a veces se notifican valores más altos.19 Los síntomas diabéticos se correlacionan bien con la dosis utilizada. En general, a dosis inferiores a 40 mg/kg de peso corporal, solo se observan ligeros cambios en los niveles plasmáticos de glucemia, glucosuria e insulina, y estos ligeros cambios tienden a normalizarse espontáneamente en hasta el 25% de los animales.18 Con una dosis suficiente de estreptozotocina, la inducción de la diabetes en ratas es fácil, rápida y confiable. Sin embargo, en la mayoría de los estudios que emplean este modelo de rata, la patogénesis de la diabetes y los síntomas asociados solo se han estudiado durante varias semanas o meses, durante los cuales la diabetes se desarrolla y mantiene completamente. Los efectos a largo plazo de la estreptozotocina y la posible recuperación de la diabetes inducida por estreptozotocina se han explorado mucho menos.

En nuestros experimentos, hicimos un seguimiento de ratas con diabetes inducida por estreptozotocina durante 1 año, y se observó recuperación en una proporción significativa de animales. Las 152 ratas mostraron diabetes en toda regla durante los primeros 6 meses del experimento; en la segunda mitad del año, se pudieron distinguir claramente dos grupos diferentes. En el grupo diabético (n = 92), la glucemia se mantuvo alta (> 18 mmol/L), el peso corporal no aumentó, los niveles plasmáticos de insulina se mantuvieron bajos y el análisis histológico reveló una reducción en el número y el tamaño de los islotes pancreáticos, con falta de células secretoras de insulina. En contraste, el grupo de recuperación (n = 60) mostró diferencias significativas en el segundo semestre del año, que no habían estado presentes en los primeros 6 meses del experimento: menor glucemia (< 12 mmol / L), aumento constante del peso corporal y niveles plasmáticos más altos de insulina, que se aproximaron a los valores encontrados en animales de control. Además, la estructura histológica de los islotes pancreáticos fue similar a la de los animales de control, con un número de células β bien conservadas. Por lo tanto, después de 6 meses hubo un grupo significativo de animales (∼ 40%) que mostraron una recuperación significativa, con una serie de parámetros que se aproximan a los valores observados en animales control no diabéticos. La única prueba que pudo distinguir de forma fiable a los animales de recuperación de los controles no diabéticos fue la prueba de tolerancia a la glucosa. La prueba de tolerancia a la glucosa se realizó en los meses 9 y 12 del experimento, y la curva para los animales de recuperación mostró valores patológicos claramente similares al grupo diabético y significativamente diferentes de los de los animales no diabéticos de control. Ambos grupos de estreptozotocina respondieron con una disminución de la secreción de insulina. En conclusión, la diabetes mellitus inducida por estreptozotocina en ratas se mantuvo estable durante 6 meses; después, sin embargo, se desarrolló una recuperación significativa en animals el 40% de los animales. La insuficiencia funcional de la recuperación en este período (7-12 meses después de la aplicación de estreptozotocina) puede descubrirse mediante la prueba de tolerancia a la glucosa. La secreción de insulina en animales de recuperación es probablemente suficiente en reposo; sin embargo, un aumento de la carga de glucosa desenmascara la tolerancia a la glucosa aún deteriorada. En la mayoría de los animales (∼ 60%) no se observó recuperación y la diabetes severa persistió durante el período de 12 meses. Ya se ha descrito una recuperación espontánea de la diabetes inducida por estreptozotocina en ratas recién nacidas, en las que se aplicó estreptozotocina al nacer,20 y en animales adultos, pero con dosis bajas de estreptozotocina.21,22

La estreptozotocina también se utiliza para la inducción de diabetes en otras especies, además de la rata. En ratones, la diabetes tipo I puede ser inducida por una sola dosis más alta de estreptozotocina o por la aplicación repetida de dosis más bajas, ambas aplicadas por vía intraperitoneal. En el caso de la aplicación de dosis única, se describe una inducción fiable para dosis de 200 mg/kg.23,24 Una desventaja grave de la aplicación de dosis única es la altísima letalidad inmediata (hasta el 90% para 180 mg/kg en nuestras manos). La aplicación repetida de estreptozotocina generalmente se realiza con dosis de 40-50 mg/kg al día aplicadas durante 5 días consecutivos.25 Los síntomas característicos de la diabetes (hiperglucemia, glucosuria, peso corporal estancado) se desarrollan después de la aplicación de la última dosis. Los ratones típicamente muestran diferencias significativas entre géneros: en ratones machos, los niveles plasmáticos de glucosa después de la aplicación de estreptozotocina fueron significativamente más altos que en ratones hembra. Dado que se sabe que la administración de testosterona aumenta la respuesta hiperglucémica en hombres y mujeres castrados, así como en mujeres no castradas, probablemente contribuye a los efectos diabéticos de la estreptozotocina.26

Los resultados en el conejillo de indias son controvertidos. Según algunos estudios, los conejillos de indias son resistentes a los efectos diabéticos de la estreptozotocina.27 Por el contrario, otros estudios describen un modelo confiable de diabetes inducida por estreptozotocina con cobayas, sobre la base de la tasa de crecimiento reducida, la disfunción de las células β, la polidipsia, la poliuria y la glucosuria.28 Las diferencias en los métodos experimentales de inducción de la diabetes, especialmente la dosificación y la aplicación, pueden ser responsables de estas discrepancias. Los métodos más recomendados incluyen intracardíacos aplicación de estreptozotocina (200 mg/kg), precedido por la administración de insulina,29 intracardíacos inyección de estreptozotocina (150 mg/kg) sin la insulina,28 o intravenosa aplicación de estreptozotocina.30 Con base en las diferencias en el método de inducción de la diabetes, los parámetros diabéticos, el curso temporal de la enfermedad y la letalidad asociada también difieren entre los modelos. En nuestras condiciones experimentales, mientras que la aplicación intraperitoneal de estreptozotocina (300 mg/kg) no indujo ningún síntoma diabético, la administración intravenosa de estreptozotocina (150 mg/kg) condujo a una glucosuria significativa. El análisis histológico del páncreas no reveló ningún signo de destrucción de los islotes, independientemente del método de administración de estreptozotocina. Incluso la glucosuria observada después de la administración intravenosa de estreptozotocina puede no ser el síntoma diabético, sino más bien el resultado de un efecto nefrotóxico directo de la estreptozotocina, que se ha descrito en pacientes. Esta hipótesis se apoya en el hecho de que una administración diaria de insulina (5 u.i./kg) no previno la glucosuria.

Con respecto al modelo de diabetes en conejos, los estudios que utilizan el modelo inducido por aloxano prevalecen claramente. Los estudios con diabetes inducida por estreptozotocina en conejos son raros y contradictorios. Hay alguna evidencia de efectos diabéticos de la estreptozotocina en conejos adultos, así como en fetos, pero otros estudios argumentan en contra de esta posibilidad.27,31-34

En mamíferos grandes, la estreptozotocina se ha utilizado con éxito para inducir diabetes en perros y cerdos. En el perro, la aplicación de estreptozotocina se asoció con una alta mortalidad y, por lo tanto, se han desarrollado varias técnicas para reducir la dosis de estreptozotocina y la mortalidad asociada. Freyse et al.35 pancreatectomía parcial combinada y infusión de estreptozotocina en dosis bajas (2 mg/kg) en la arteria pancreatoduodenal superior. Otras técnicas incluyen la administración intravenosa combinada de estreptozotocina y aloxano, y la infusión intrarterial suprarrenal de estreptozotocina y aloxano después de la oclusión con balón de la aorta abdominal yuxtarrenal.36,37 Otra especie de mamífero grande sensible a los efectos diabéticos de la estreptozotocina es el cerdo (y el minipig). Para un efecto diabético fiable de la estreptozotocina tanto en cerdos como en minipig, se necesita una dosis de 100-150 mg/kg.En minipigs, también se ha notificado una inducción exitosa de la diabetes con dos dosis bajas (40 mg/kg).39