Regulación del Retículo Sarcoplásmico Cardíaco Captación de Ca2 + por Fosfolambano

A principios de la década de 1970, Arnold Katz (Tada et al1) informó de un descubrimiento que demostró que la fosforilación de membranas aisladas del retículo sarcoplásmico cardíaco se producía principalmente en una proteína de bajo peso molecular. Esta fosfoproteína fue llamada fosfolamban, de las palabras de la raíz griega que significan «recibir fosfato».»1 El fosfolambano es una pequeña proteína, que contiene 52 residuos de aminoácidos, y está presente en los músculos esqueléticos cardíacos, lisos y de contracción lenta. Sin embargo, sus efectos reguladores se han estudiado principalmente en el músculo cardíaco. Los estudios in vitro indicaron que el fosfolambano puede ser fosforilado en tres sitios distintos por varias proteínas quinasas: la serina 10, por la proteína quinasa C; la serina 16, por la proteína quinasa dependiente de cAMP o cGMP; y la treonina 17, por la proteína quinasa dependiente de Ca2+ – calmodulina.23 Cada fosforilación está asociada con la estimulación de las tasas iniciales de captación de Ca2+ en el retículo sarcoplásmico cardíaco, que es principalmente pronunciada a baja , lo que resulta en un aumento general de la afinidad de la bomba de Ca2+ por Ca2+.45 Sobre la base de estas observaciones, inicialmente se planteó la hipótesis de que el fosfolambano fosforilado funciona como un estimulador de la enzima Ca2+-ATPasa (SERCA2) del retículo sarcoplásmico cardíaco. Sin embargo, a finales de la década de 1980, se produjo un avance significativo que demostró que el fosfolambano desfosforilado es en realidad un inhibidor del transporte de Ca2+ del retículo sarcoplásmico cardíaco para Ca2+ y que la fosforilación alivia este efecto inhibitorio, dando la apariencia de estimulación inducida por fosforilación.6 Este hallazgo, junto con la identificación de una proteína fosfatasa asociada al retículo sarcoplásmico cardiaco que puede desfosforilar fosfolambán7,nos ha llevado a comprender actualmente el fosfolambán como un inhibidor reversible de la actividad de la ATPasa Ca2+ del retículo sarcoplásmico cardiaco.

El fosfolambano también se fosforila in situ durante la estimulación β-adrenérgica. Estudios en corazones latentes intactos o miocitos cardíacos aislados han demostrado que tanto la serina 16 como la treonina 17 en el fosfolambano se fosforilan durante la estimulación con isoproterenol.89 Se sugirió que la fosforilación del fosfolambano y los aumentos acompañados en las tasas de captación de Ca2+ del retículo sarcoplásmico cardíaco eran al menos parcialmente responsables de los efectos estimulantes de los agonistas β en el corazón de los mamíferos.

Características estructurales del fosfolambano

La estructura del fosfolambano no se conoce actualmente, pero en base a su secuencia de aminoácidos, se han propuesto varios modelos. Se acepta generalmente que hay dos dominios principales: un dominio hidrofílico (AA 1-30, que indica residuos de aminoácidos 1 a 30), que contiene los tres sitios de fosforilación, y un dominio hidrofóbico (AA 31-52), que está anclado en la membrana del retículo sarcoplásmico cardíaco. Se ha sugerido que parte del dominio hidrofílico está en una configuración helicoidal, y la fosforilación del fosfolambano puede desenrollar o interrumpir esta configuración estructural.10 La evidencia de varios laboratorios indicó la importancia del dominio hidrofílico en la mediación de los efectos reguladores del fosfolambano en la bomba Ca2+ del retículo sarcoplásmico cardíaco.6111213 En realidad, se ha sugerido que AA 2-18 en fosfolambano interactúa con AA 336-412 y 467-762 en SERCA2 para la modificación funcional.14

También se ha propuesto que el dominio hidrofóbico del fosfolambano tenga una estructura helicoidal. Actualmente no hay evidencia clara de que este dominio interactúe con la bomba de retículo sarcoplásmico cardíaco Ca2+, aunque varios estudios han sugerido que la porción hidrofóbica del fosfolambano también es importante para mediar los efectos reguladores.1215 Los residuos de cisteína en el dominio transmembrana α-helicoidal proporcionan interacción no covalente entre formas monoméricas y contribuyen a la estabilización de una estructura pentamérica para el fosfolambano.16 El análisis de pentámeros de fosfolambano indicó que la formación de pentámeros era la de un haz helicoidal de bobina enrollada zurda, con un poro de iones cilíndrico.17 Evidencia reciente demostró que una cremallera de leucina estabiliza la asociación pentamérica de fosfolambano y forma un poro iónico central, 18 que puede permitir la transferencia de iones selectivos de Ca2+.19 Sin embargo, actualmente no está claro si el ensamblaje pentamérico es esencial para la regulación funcional del retículo sarcoplásmico cardíaco Ca2+ ATPasa. Los estudios de expresión en sistemas libres de células han indicado que las formas monoméricas y pentaméricas del fosfolambano son igualmente eficaces para mediar los efectos reguladores en la bomba Ca2+.14

Otra teoría sobre la interacción fosfolambano–Ca2+-ATPasa propuso una asociación dimérica de las proteínas de bomba Ca2+ alrededor de un pentámero de fosfolambano.20 Este modelo, basado en la anisotropía de fosforescencia resuelta en el tiempo, describió una interacción preferencial entre la bomba libre de Ca2+y el fosfolambano desfosforilado. La fosforilación de fosfolambano desestabilizó la interacción y dio lugar a un aumento de la movilidad rotacional de la Ca2+-ATPasa en la membrana del retículo sarcoplásmico cardíaco.20

Regulación de la Contractilidad miocárdica basal por Fosfolambano

El papel del fosfolambano en la regulación de la contractilidad miocárdica basal se ha dilucidado recientemente a través del desarrollo de un ratón con deficiencia de fosfolambano.21 Estos ratones, creados utilizando una metodología de orientación genética en células madre embrionarias murinas, mostraron una función cardíaca hiperdinámica, que incluía un aumento de la función sistólica, un aumento de las tasas de relajación ventricular izquierda21 y un aumento del llenado ventricular.22 Los corazones con deficiencia de fosfolambano no solo se relajaron más rápido que los corazones de tipo salvaje, sino que también exhibieron parámetros inotrópicos mejorados, incluyendo tasas aumentadas de desarrollo de presión, que se evaluaron en preparativos para el trabajo21 e in vivo, utilizando análisis ecocardiográficos.22 Estos hallazgos fueron corroborados por análisis in vitro de cardiomiocitos ventriculares aislados de corazones con deficiencia de fosfolambano, que también mostraron una mejora de las tasas de relengenización, acortamiento y cinética de Ca2+.23 Los parámetros contráctiles mejorados reflejaban alteraciones subcelulares a nivel del retículo sarcoplásmico cardíaco. La afinidad de la bomba de Ca2+ por el Ca2+ aumentó significativamente, y esto se asoció con un aumento del contenido de Ca2+ en el retículo sarcoplásmico cardíaco intraluminal en los corazones con deficiencia de fosfolambano en comparación con los corazones de tipo salvaje.21

La importancia funcional del fosfolambano en la regulación de la contractilidad cardíaca se ha corroborado en estudios con ratones heterocigotos de fosfolambano, que contienen solo un alelo dirigido a fosfolambano.24 Los corazones de estos ratones expresan el 40% de los niveles de fosfolambano presentes en los corazones de ratones de tipo salvaje, y esta expresión reducida de fosfolambano se asocia con aumentos en la afinidad del sistema de transporte de Ca2+ del retículo sarcoplásmico cardíaco para Ca2+ y aumentos en los parámetros contráctiles. Es interesante observar que cuando los niveles de fosfolambano en corazones de tipo salvaje, heterocigotos y deficientes de fosfolambano se compararon con las tasas de contracción y relajación de estos corazones, se observó una estrecha correlación lineal (Fig.1), lo que sugiere un papel prominente para el fosfolambano en la regulación de los parámetros contráctiles basales en el corazón de los mamíferos. Además,dado que los niveles del retículo sarcoplásmico cardíaco Ca2+ ATPasa no se vieron afectados en estos corazones genéticamente alterados25, estos datos indican que las alteraciones en los niveles de fosfolambano, que pueden reflejar alteraciones en la estequiometría relativa del fosfolambano al retículo sarcoplásmico cardíaco Ca2+ ATPasa, se asocian con alteraciones paralelas en los parámetros contráctiles cardíacos. Sin embargo, la estequiometría funcional del fosfolambán al retículo sarcoplásmico cardíaco Ca2+ ATPasa no se conoce actualmente. Los estudios in vitro han notificado valores que varían entre 1:5 y 5:1 para fosfolambano / SERCA2. Estudios in vivo con ratones transgénicos, que sobreexpresan fosfolambano específicamente en el corazón, sugirieron que la» estequiometría funcional » de fosfolambano/SERCA2 es inferior a 1:1 en membranas de retículo sarcoplásmico cardíaco nativo.26 Los niveles de proteína de fosfolambano en los corazones de estos ratones transgénicos fueron dos veces más altos en comparación con los corazones de tipo salvaje, y el aumento de la expresión de fosfolambano dio lugar a un aumento de la inhibición de la afinidad de Ca2+-ATPasa por Ca2+, sin ningún efecto sobre la Vmáx de esta enzima.26 Además, cuando se trazaron los niveles relativos de fosfolambano a la ATPasa Ca2 + del retículo sarcoplásmico cardíaco frente a los valores de CE50 de la Ca2+-ATPasa para Ca2+ en corazones con sobreexpresión de fosfolambano, tipo salvaje, heterocigoto de fosfolambano y deficientes de fosfolambano, se observó una estrecha correlación lineal (Fig 2), lo que indica que el fosfolambano sobreexpresión en los corazones transgénicos estaba acoplado funcionalmente a la Ca2+-ATPasa. La disminución de la afinidad de la Ca2+-ATPasa por Ca2+ en los corazones de sobreexpresión de fosfolambano se asoció con disminuciones en los parámetros contráctiles y depresión de los transitorios de Ca2+ en miocitos cardíacos aislados en comparación con los miocitos de corazones de tipo salvaje.26 Los análisis ecocardiográficos de corazones de estos ratones transgénicos demostraron un acortamiento fraccional y circunferencial significativamente suprimido en comparación con corazones de ratones silvestres.26 Tomados en conjunto, estos estudios en ratones genéticamente alterados indican que el fosfolambano es un potente represor de los parámetros de contracción y relajación en el corazón de los mamíferos.

El papel del Fosfolambano en la Respuesta β-Adrenérgica miocárdica

Los estudios en corazones latentes aislados y miocitos cardíacos han demostrado que la administración de catecolaminas resulta en la fosforilación del fosfolambano en el retículo sarcoplásmico cardíaco, el fosfolemo en las membranas sarcolémicas y la proteína troponina I y C en las miofibrillas. Sin embargo, las tasas de reacciones de fosforilación/desfosforilación en el fosfolambano parecen ser más rápidas que las de las otras fosfoproteínas, y se ha sugerido que el fosfolambano es un mediador prominente de las respuestas β-adrenérgicas en el corazón de los mamíferos. La fosforilación del fosfolambano, en respuesta al aumento de los niveles de AMPc durante la administración de agonistas β, se acompaña de un aumento de la actividad del sistema de transporte Ca2+ del retículo sarcoplásmico cardíaco y de un aumento de las tasas de relajación cardíaca.272829 El aumento de las tasas de captación de Ca2+ lleva a un aumento de los niveles de secuestro de Ca2+ del retículo sarcoplásmico cardíaco, que están disponibles para contracciones posteriores, lo que lleva a un aumento de la fuerza contráctil. Sin embargo, el fosfolambano no solo es fosforilado por la proteína quinasa dependiente de cAMP en la serina 16, sino también por la proteína quinasa Ca2+-calmodulina en la treonina 17,89 y la contribución relativa de cada fosforilación en los efectos inotrópicos y lusitrópicos de los agonistas β no se conoce actualmente.

El papel funcional del fosfolambano en la vía de señalización β-adrenérgica se ha dilucidado recientemente utilizando el ratón deficiente en fosfolambano. Los estudios in vitro en miocitos aislados y preparados cardíacos de estos ratones indicaron una atenuación significativa de los efectos inotrópicos y lusitrópicos del isoproterenol en comparación con los preparados de tipo silvestre.2123 Además, estudios in vivo utilizando análisis ecocardiográficos de corazones ablados con fosfolambano demostraron que los efectos estimulantes β-adrenérgicos también se atenuaron en el animal intacto.22 Por lo tanto, aunque el fosfolambano no es la única proteína involucrada en la transducción de la señalización β-adrenérgica cardíaca, la evidencia experimental hasta la fecha indica que es una proteína importante. La función del fosfolambano durante la estimulación con catecolaminas del corazón sugiere un papel para esta proteína como un «mecanismo de freno» interno, que permite una reacción miocárdica rápida, de modo que cuando se libera adrenalina en una situación de «lucha o huida», el «freno» del fosfolambano se alivia, lo que permite un aumento rápido de la contracción y relajación cardíacas.

Regulación de la expresión de Fosfolambano

El fosfolambano es el producto de un solo gen, y ha sido clonado de varias especies, incluyendo el cerdo, el pollo, el ratón y el humano. Existe > una homología del 96% entre las regiones codificantes del gen fosfolambano entre estas especies, y no se han detectado isoformas de fosfolambano hasta la fecha.30 El gen fosfolambano se ha mapeado al cromosoma 6 humano.31 Estudios en ratones han demostrado que, con respecto al sistema circulatorio, el fosfolambano se expresa de manera diferente, variando desde niveles altos de expresión en el músculo ventricular, hasta niveles intermedios en los músculos miocárdicos auriculares y pulmonares, y hasta niveles bajos pero funcionalmente significativos de expresión en el músculo liso aórtico. Los niveles diferenciales de expresión de fosfolambano en los compartimentos ventricular y auricular parecían correlacionarse con diferencias en los parámetros contráctiles de estos músculos.32

La expresión de fosfolambano también se ha demostrado que está regulada durante el desarrollo y el envejecimiento. Se han observado aumentos en la expresión de fosfolambano a lo largo del desarrollo cardíaco en ratones, pollos, ratas y conejos.31323334 Además, se ha sugerido que los decrementos en la fosforilación de fosfolambano en el corazón de rata envejecido están asociados con la disminución de las respuestas contráctiles de estos corazones a la estimulación con catecolaminas.

La expresión de fosfolambano miocárdico también se ha demostrado que está regulada por el estado tiroideo tanto en la rata como en el conejo.3435 Durante el hipotiroidismo, los niveles de ARNm de fosfolambano no se modificaron en la aurícula y el ventrículo de conejo, mientras que los niveles de proteína de fosfolambano aumentaron en corazones de rata. Estos niveles elevados de fosfolambano en el corazón de rata se asociaron con una disminución de las tasas de captación de Ca2+ del retículo sarcoplásmico cardíaco, consistente con un aumento de la inhibición de la bomba de Ca2+ del retículo sarcoplásmico cardíaco y una disminución de la contractilidad.Se observaron efectos reguladores opuestos para la expresión de fosfolambano durante el hipertiroidismo.El hipertiroidismo se asoció con una disminución de los niveles de ARNm de fosfolambano en aurículas y ventrículos de conejo y una disminución de los niveles de proteína de fosfolambano en corazones de rata. Las disminuciones en los niveles de fosfolambano se reflejaron en un aumento de las tasas de captación de Ca2+ del retículo sarcoplásmico cardíaco, consistente con la desinhibición de la bomba de Ca2+ y la mejora de los parámetros contráctiles.

Investigaciones recientes de alteraciones en la expresión génica, que ocurren durante la insuficiencia cardíaca, indicaron que las alteraciones en la relación relativa de fosfolambano a la ATPasa SR Ca2+ pueden ser un sello distintivo de esta enfermedad.363738 Sin embargo, existe cierta discrepancia en la literatura en cuanto a cómo se altera la expresión de fosfolambano durante la insuficiencia miocárdica. Algunos estudios realizados en corazones humanos fallidos han demostrado reducciones en el ARNm de fosfolambán37 o en la proteína de fosfolambán363738,mientras que otros estudios no observaron alteraciones aparentes en los niveles de fosfolambán de corazones humanos fallidos.39404142 Aunque sigue habiendo controversia con respecto a las alteraciones del fosfolambano durante la insuficiencia cardíaca, es evidente que las alteraciones intracelulares, que se asocian con la represión de la contractilidad cardíaca, sugieren un papel del fosfolambano en la etiología de la enfermedad.

Resumen

Nuestra comprensión del papel del fosfolambano en la fisiología cardíaca ha evolucionado en las últimas dos décadas hasta el punto de que ahora se entiende que esta proteína es un represor crítico de la contractilidad miocárdica. El fosfolambano, a través de sus efectos inhibidores sobre la afinidad de la bomba de retículo sarcoplásmico cardíaco Ca2+ por Ca2+, reprime tanto las tasas de relajación como de contracción en el corazón de los mamíferos. Estos efectos inhibitorios se pueden aliviar a través de (1) fosforilación de fosfolambano, (2) regulación a la baja de la expresión génica de fosfolambano, y (3) interrupción de la interacción fosfolambano–Ca2+-ATPasa. Por lo tanto, los abordajes genéticos y las intervenciones farmacológicas, diseñados para aliviar la acción inhibitoria del fosfolambano sobre la bomba del retículo sarcoplásmico cardíaco Ca2+ y la relajación miocárdica, pueden resultar valiosos para revertir los efectos de varias enfermedades en el corazón de los mamíferos. Tales intervenciones podrían diseñarse para inhibir la fosfolamban fosfatasa, estabilizar el estado fosforilado de fosfolamban, interrumpir la interacción fosfolamban-Ca2+-ATPasa, disminuir la transcripción de fosfolamban o interrumpir la estabilidad del ARNm de fosfolamban. El desarrollo de tales estrategias terapéuticas para atacar el fosfolambano será un objetivo futuro importante para la mejora clínica de la contractilidad en el corazón fallido.

Notas a pie de página