Introducción

Los agentes que inducen o inician la vasodilatación, el ensanchamiento de los vasos sanguíneos, son vasodilatadores, que se utilizan con frecuencia para tratar afecciones con presión arterial anormalmente alta, como hipertensión, angina e insuficiencia cardíaca congestiva (Bader y Zolty, 2010; Whelton et al., 2018). Se han aprobado en la clínica tipos de vasodilatadores con diferentes mecanismos, como bloqueadores de los canales de calcio, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ECA), inhibidores de la fosfodiesterasa cíclica 3′,5’específicos de GMPc (PDE5) y abridores de canales de potasio (Saji et al., 2014). A pesar de la gran cantidad de opciones de vasodilatadores, algunos problemas, como la universalidad y gravedad de la presión arterial alta, la resistencia a los medicamentos y la dependencia a los medicamentos, deben abordarse, en parte, mediante el desarrollo de nuevos medicamentos (Oparil y Schmieder, 2015). A diferencia de los fármacos actuales con dianas específicas para dilatar los vasos sanguíneos, nuestro objetivo es construir una estrategia alternativa que sea capaz de explorar sistemáticamente los vasodilatadores recapitulando la red molecular de vasodilatación.

Los enfoques de biología de sistemas son naturalmente adecuados para capturar las lecturas imparciales y a gran escala de sistemas complejos (Berger e Iyengar, 2009). Los métodos basados en perfiles de expresión son los más generales, utilizando perfiles transcripcionales como firmas de la actividad de una determinada vía, enfermedad o compuesto para descubrir » conexiones «entre ellos en función de sus efectos transcripcionales (anti)correlacionados, como el» Mapa de Conectividad » (Lamb et al., 2006). Inspirado por esta consideración, está concebido para construir módulos génicos funcionales específicos del fenotipo vascular a partir del mapa funcional a escala genómica. Los cambios de los módulos deben asociarse en gran medida con la patogénesis del diámetro vascular. Los módulos se pueden utilizar como consultas para examinar la respuesta transcripcional de medicamentos para identificar candidatos a vasodilatadores.

La medicina tradicional china (MTC), con hierbas naturales como materiales principales, ha desempeñado un papel crucial en la salud humana en China. La MTC involucra muchos ingredientes activos, que generalmente se usan como fuente de nuevas entidades químicas para el descubrimiento de medicamentos modernos (Tian, 2011). Los recientes esfuerzos de colaboración a gran escala han producido compendios de perfiles moleculares para ingredientes herbales(Lv et al., 2017). En el presente trabajo, buscamos construir una estrategia de referencia de módulos de genes funcionales (TFGMR) basada en transcriptomas que sea capaz de caracterizar módulos de genes funcionales relacionados con el diámetro vascular en los datos transcripcionales de una colección de compuestos herbales para evaluar el impacto de estos compuestos en el diámetro vascular.

Materiales y métodos

Datos de Expresión génica y Preprocesamiento

Los datos de expresión génica de compuestos herbales se obtuvieron de un estudio sistemático de componentes de MTC utilizando la técnica de microarray de expresión génica (Lv et al., 2017). Estos pequeños compuestos eran comunes en hierbas chinas y fórmulas de MTC, y la mayoría de ellos son los componentes de control de calidad de las MTC de la Farmacopea China. Los datos de expresión génica se derivaron de la línea celular epitelial del cáncer de mama humano (MCF7) tratada con estos compuestos herbales, perfilada con tecnología de microarray con el Genoma Humano Affymetrix U133A 2.0 y recolectada del Omnibus de Expresión Génica del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) (número de acceso a la serie GEO: GSE85871). Los datos sin procesar (archivos CEL) se procesaron de manera consistente aplicando el procedimiento específico de la plataforma Affymetrix para filtrar y normalizar conjuntos de datos. Luego, para cada compuesto herbal, los valores diferenciales de expresión génica frente a las muestras de control se calcularon mediante el paquete R «Limma» (versión 3.32.7). La lista de genes para cada compuesto se produjo ordenando genes en una lista clasificada de acuerdo con sus valores de expresión diferenciales.

Identificación del Módulo Génico Funcional de Regulación del Diámetro de los Vasos Sanguíneos

En este trabajo se construyeron dos módulos génicos funcionales que regulan positiva y negativamente el diámetro de los vasos sanguíneos (PFGM y NFGM). En primer lugar, se recogieron dos procesos biológicos de Ontología génica (GO): «regulación positiva del diámetro de los vasos sanguíneos» (GO: 0097755) y «regulación negativa del diámetro de los vasos sanguíneos» (GO: 0097756) de QuickGO: una herramienta basada en la web para la búsqueda de GO (http://seek.princeton.edu/) (Zhu et al., 2015). Los genes resultantes con puntuación de coexpresión > 0 y valor de P < 0,01 en SEEK se consideraron genes coexpresión de los genes del núcleo de consulta. Finalmente, se eliminaron los genes superpuestos en dos conjuntos de genes, y los genes restantes compuestos por PFGM y NFGM, respectivamente (Tablas suplementarias 1 y 2).

Análisis de Enriquecimiento de Módulos de Genes Funcionales en Perfiles de Expresión Génica Inducidos por Compuestos Herbales

Los enriquecimientos de PFGM y NFGM con perfiles de expresión génica inducidos por compuestos herbales se evaluaron utilizando el enfoque de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA), implementado en los paquetes R, «GSEA-P» (Subramanian et al., 2005). La GSEA calcula la (S) Puntuación (ES) de Enriquecimiento de los conjuntos de genes con respecto a la lista de clasificación. El rango de valores ES es . Es una medida basada en las estadísticas de Kolmogorov–Smirnov y evalúa la sobrerrepresentación de conjuntos de genes en los extremos (superior o inferior) de la lista clasificada. Cuanto más cerca está el ES de 1, más cerca están los genes de la parte superior de la lista (los genes tienden a aumentar en la afección). Cuanto más cerca de -1, más cerca están los genes de la parte inferior de la lista (los genes tienden a reducirse en la afección).

En este trabajo, PFGM y NFGM representan firmas moleculares del diámetro del vaso sanguíneo. Para evaluar los efectos de los compuestos herbales en el diámetro de los vasos sanguíneos, se midieron los valores de ES (ESPFGM y ESNFGM) de PFGM y NFGM para cada perfil de expresión génica inducida por compuestos. El valor TES = ESPFGM − ESNFGM se utilizó como índice para evaluar la influencia de cada compuesto herbal en el diámetro del vaso sanguíneo. Para un compuesto, cuanto mayor sea su valor de STE, mayor será su capacidad para dilatar los vasos sanguíneos. Cuanto menor sea su valor de STE, mayor será su capacidad para estrechar los vasos sanguíneos.

Caracterización de los Genes Regulados por Compuestos en PFGM y NFGM

En este trabajo, para cada compuesto, sus genes regulados en PFGM y NFGM son equivalentes al subconjunto de vanguardia que se define como los miembros centrales de los dos módulos que contribuyen al ES en el método GSEA. El subconjunto de vanguardia se puede interpretar como el núcleo de un conjunto de genes que da cuenta de la señal de enriquecimiento. El subconjunto de vanguardia de PFGM y NFGM para cada perfil de expresión génica inducida por compuestos se puede extraer mediante el método implementado en los paquetes R, GSEA-P.

Productos químicos y medicamentos

Ácido ferúlico (98% de pureza), liquiritin (98% de pureza), magnolol (98% de pureza) y ginsenósido Rb2 (93,8% de pureza) se obtuvieron de los Institutos Nacionales para el Control de Alimentos y Medicamentos (NIFDC, Beijing, China). Borneol (98% de pureza), ginsenósido Rc (98% de pureza), artemisinina (99% de pureza), ácido quenodesoxicólico (98% de pureza), daidzina (98% de pureza) y bacopasida I (98% de pureza) se compraron a Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd. Otros reactivos eran de pureza analítica.

Animales experimentales

Cuarenta ratas macho Sprague-Dawley (SD) con un peso de 230-250 g a la edad de 7-9 semanas y se compraron en el Centro de Cría de Animales de Beijing Vital River Laboratories Company (Beijing, China). Las ratas se mantuvieron en un ciclo de luz / oscuridad de 12 h y tuvieron acceso gratuito a alimentos y agua. Los animales fueron atendidos por el Centro de Cuidado de Animales de Laboratorio de la Academia China de Ciencias Médicas Chinas. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones de las directrices institucionales y la ética. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética y Bienestar Animal de la Academia China de Ciencias Médicas Chinas.

Preparación de Anillos Aórticos para Mediciones de Tensión

El experimento ex vivo se realizó en aortas torácicas de ratas de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente (Chen et al., 2019). Es decir, las ratas fueron anestesiadas por inyección intraperitoneal de hidrato de cloral y luego sacrificadas por dislocación cervical. Después de abrir el tórax, se obtuvieron las aortas torácicas de las ratas y se colocaron inmediatamente en solución helada de Krebs–Henseleit (KH) de la siguiente composición (en mmol/L): NaCl 120, KCL 4,8, MgSO4•7H2O 1,2, KH2PO4 1,2, CaCl2 2,5, NaHCO3 25 y glucosa 11 (pH 7,4). El tejido graso adherido a las arterias se extirpó cuidadosamente para evitar el daño de las células endoteliales, y el vaso sanguíneo se cortó en anillos de aproximadamente 3 mm de largo. En los experimentos sin endotelio, el endotelio se eliminó mecánicamente frotando suavemente la superficie luminal del anillo aórtico varias veces con tubos de plástico. Los anillos aórticos se suspendieron en baños de órganos que contenían 5 ml de solución de KH a 37 ° C gaseosa con 95% de O2 + 5% de CO2, que se mantuvo constantemente a lo largo de los experimentos. Después del equilibrio bajo tensión no durante 20 min, se permitió que los anillos aórticos se equilibraran durante 90 min a una tensión de reposo de 1,0 g. Durante el período de equilibrio, la solución de KH se cambió cada 20 min. Los cambios de tensión se registraron mediante transductores de fuerza (FT-102, Chengdu Techman Software Co., Ltd. China) conectado a un sistema de adquisición de datos (BL-420F, Chengdu Techman Software Co., Ltd. China) y se almacenaron en una computadora. Además, para asegurar la precisión y repetibilidad del estudio, se seleccionó 3,0–4,5 g como criterio de inclusión de la fuerza precontractil según experimentos preliminares.

Efectos de los Componentes Herbales sobre la Contracción Inducida por Fenilefrina

En la contracción constante inducida por fenilefrina (Phe) (1 µmol/L) en anillos aórticos, se añadió directamente al baño de órganos una concentración acumulada de componentes herbales (disueltos en solución de KH o que contenían DMSO al 0,2%) y se registró el efecto del componente herbal. El mismo volumen de solución de KH se añadió al grupo de control del vehículo, y las respuestas se detuvieron lavando los anillos aórticos con solución de KH fresca. Los efectos se expresaron como el porcentaje de relajación inducida por componentes herbales.

Análisis de datos

En primer lugar, para evaluar la importancia de los efectos de los compuestos herbales en el fenotipo vascular representado por los dos módulos funcionales, se calculó un valor nominal de P para cada valor de STE comparando la distribución del valor real con un modelo nulo que obtuvo valores de STE para cada compuesto mediante muestreo aleatorio de miembros génicos de PFGM y NFGM 1.000 veces con números conservados de los dos módulos (Tabla Suplementaria 3). En segundo lugar, la importancia del análisis de superposición entre la regulación de los seis compuestos con efectos relajantes se midió mediante la prueba exacta de Fisher (Tabla Suplementaria 5). Finalmente, el análisis estadístico de la anotación funcional de conjuntos de genes en WebGestalt (http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/annotate.jsp) sigue las instrucciones del sitio web correspondiente.

La actividad vasorelaxatoria se expresa como porcentaje de relajación de los niveles de precontracción de Phe (1 µmol/L). Los valores se expresan como la media ± DE de los resultados de las ocho muestras. Las diferencias entre los grupos se determinaron mediante un análisis de varianza unidireccional. La significación estadística se definió como P < 0,05. La concentración del 50% de los valores de efecto máximo (CE50) de los experimentos in vitro se obtuvo mediante regresión no lineal. La generación de gráficos y el análisis estadístico se realizaron utilizando GraphPad Prism (Software GraphPad, versión 5.01) y el software SPSS 18.0.

Resultados

Referencia del Módulo Génico Funcional Basado en Transcriptomas

Presentamos una estrategia de TFGMR capaz de enriquecer los módulos génicos funcionales relacionados con la enfermedad en perfiles transcripcionales inducidos por fármacos para detectar la capacidad terapéutica de los fármacos para enfermedades mediante la regulación de mecanismos funcionales específicos. Aquí, la TFGMR se aplica a los recursos de transcriptoma para 102 componentes herbales para descubrir sistemáticamente nuevos vasodilatadores regulando el diámetro de los vasos sanguíneos (Figura 1). En primer lugar, construimos dos módulos génicos funcionales PFGM y NFGM que regulan positiva y negativamente el diámetro de los vasos sanguíneos. La PFGM contiene 167 miembros de genes, de los cuales 55 genes centrales derivados de la «regulación positiva del diámetro de los vasos sanguíneos» de GO BP (GO: 0097755) y 112 genes coexpresados de los genes centrales (Tabla Suplementaria 1). NFGM contiene 122 miembros, incluyendo 72 genes centrales de GO BP «regulación negativa del diámetro de los vasos sanguíneos» (GO: 0097756) y sus 50 coexpresiones (Tabla Suplementaria 2). Luego, examinamos el enriquecimiento de ambos PFGM y NFGM en cada uno de los perfiles de expresión génica inducida por compuestos herbales mediante el enfoque GSEA para evaluar el efecto de cada compuesto herbal en el diámetro de los vasos sanguíneos.

Caracterización del Módulo Génico Funcional de Regulación del Diámetro de los Vasos Sanguíneos

Caracterizamos PFGM y NFGM con respecto al enriquecimiento de GO y de vías para evaluar la asociación funcional de los dos módulos con el fenotipo vascular mediante el uso de WebGestalt (Liao et al., 2019). El análisis de GO de los 10 puntos básicos mostró que tanto la MGFF como la MGFF implican los mismos puntos básicos de «homeostasis de cationes inorgánicos divalentes», «regulación del tamaño de la estructura anatómica», «proceso del sistema circulatorio», «proceso del sistema muscular», «vía de señalización del receptor acoplado a proteína G» y «señalización mediada por un segundo mensajero» (Figura 2). De manera similar, el análisis de las 10 principales vías de la enciclopedia de genes y genomas de Kyoto (KEGG) mostró que los dos módulos estaban significativamente involucrados en las vías de «regulación de la lipólisis en adipocitos», «ruta de señalización de la proteína quinasa dependiente de guanosina monofosfato cíclica (GMPc)-GMPc», «ruta de señalización del calcio», «contracción del músculo liso vascular» e «interacción neuroactiva entre ligando y receptor» (Figura 2). Los términos GO y pathway enriquecidos para PFGM y NFGM están obviamente relacionados con el fenotipo vascular.

Predicción de Vasodilatadores Candidatos A Partir de Componentes Herbales por TFGMR

Nuestra suposición es que los vasodilatadores deben aumentar principalmente la expresión de los miembros de PFGM (ESPFGM > 0) y disminuir la de NFGM (ESNFGM < 0). Por lo tanto, se seleccionó el valor TES = ESPFGM − ESNFGM como índice para identificar vasodilatadores candidatos. Para un compuesto, cuanto mayor sea su valor de STE, mayor será su capacidad para dilatar los vasos sanguíneos. Las listas de genes ordenadas se produjeron en primer lugar para los 102 perfiles de expresión génica inducidos por componentes herbales. Luego, se utilizó el método GSEA para medir el valor de TES para cada compuesto herbal. Los 102 compuestos se ordenaron por sus valores de EET y se detallaron en la Tabla Suplementaria 3. Los 10 compuestos candidatos principales y sus valores de EET se enumeran en la Tabla 1.

Los Efectos Vasorrelajantes de los 10 Principales Componentes Candidatos en Anillos Aórticos contraídos con Fe

Los efectos vasorrelajantes de los 10 principales vasodilatadores candidatos previstos se evaluaron en la tensión vascular de los anillos de aorta torácica intactos con endotelio estrechados por Fe. La traza original típica mostró que la solución de KH (grupo control, contenía 0,2% de DMSO) no relajaba los anillos vasculares preacondicionados con Phe (Figura suplementaria 1). En comparación con el grupo de control, todos los 10 componentes herbales demostraron efectos vasorrelajantes significativos y dependientes de la dosis en los anillos aórticos contraídos con fe (P < 0,05, Figura 3). Entre ellos, el ácido ferúlico presentó la vasodilatación más potente (Emax = 87,46 ± 2,90%), mientras que la potencia mínima fue inducida por la liquiritina (Emax = 11,10 ± 3,34%) (Figura 3 y Tabla 1). Este alto nivel de nuevas predicciones indicó que la estrategia de TFGMR es prácticamente útil en la predicción de nuevos agentes vasorrelajantes y tiene aplicaciones potenciales en el desarrollo de fármacos.

Mecanismos de Inferencia de Compuestos Herbales Con Efectos Vasorrelajantes

Se investigaron los seis compuestos con efectos relajantes obvios por sus mecanismos correspondientes basados en su regulación sobre PFGM y NFGM. En primer lugar, examinamos genes centrales que están regulados significativamente en los dos módulos por los seis compuestos. Para cada compuesto, los genes regulados son los miembros del subconjunto de vanguardia del análisis de enriquecimiento (ver Materiales y métodos). Como se muestra en la Tabla suplementaria 4, influencia del ácido ferúlico, el borneol, la daidzina, el magnolol, el ácido quenodesoxicólico y la artemisinina 67, 59, 50, 58, 59, y 59 genes en PFGM, y 52, 49, 39, 44, 44, y 43 genes en NFGM, respectivamente. Se compararon los genes regulados de estos compuestos y se encontró que los genes regulados de los seis compuestos se superponen significativamente entre sí (Tabla suplementaria 5, Prueba exacta de Fisher P << 0.01), lo que implica que los seis compuestos comparten mecanismos similares para sus efectos relajantes. Esto fue validado por el análisis funcional de estos genes regulados de estos compuestos. En los 27 principales términos de GO enriquecido, los genes regulados de los seis compuestos enriquecidos significativamente en ocho mismos términos de GO relacionados con el fenotipo vascular, incluido el proceso vascular en el sistema circulatorio, la regulación de la vasoconstricción, la regulación del tamaño del tubo, la regulación del proceso del sistema, la regulación de la circulación sanguínea, la regulación del tamaño de la estructura anatómica y el proceso del sistema circulatorio. Además de los mecanismos similares, cada compuesto también tiene su mecanismo exclusivo. Por ejemplo, el ácido ferúlico y el ácido quenodesoxicólico pueden regular los genes en el término GO «homeostasis iónica».»El Borneol afecta significativamente a los genes en términos de GO» regulación del movimiento de los componentes celulares » y «adhesión biológica» (Figura 4 y Tabla Suplementaria 6).

Discusión

La hipertensión arterial contribuye a las consecuencias fisiopatológicas de la mayoría de las enfermedades cardiovasculares. Por lo tanto, inhibir o revertir la presión arterial alta es una estrategia invaluable para tratar las enfermedades cardiovasculares y el daño orgánico relacionado (Carey et al., 2018). Aunque ha habido más de 69 fármacos en 15 clases diferentes de fármacos antihipertensivos, como antagonistas del calcio, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina, antagonistas de los receptores adrenérgicos β, diuréticos y vasodilatadores de acción directa, muchos más pacientes hipertensos tienen hipertensión resistente o no están controlados por no adherencia o intolerancia a los agentes antihipertensivos disponibles (Oparil y Schmieder, 2015). Por lo tanto, todavía se necesitan nuevos agentes para combatir la presión arterial alta. La mayoría de las MCT contienen cientos de componentes químicos, que son la sustancia base de la farmacología de la MCT y proporcionan una fuente abundante para el descubrimiento de fármacos químicos. En este trabajo, investigamos sistémicamente los efectos de los ingredientes herbales en el fenotipo vascular utilizando un enfoque basado en transcriptomas, TFGMR.

Se ha informado que la tensión vascular desempeña un papel crítico en la regulación de la presión arterial. Uno de los mecanismos dominantes de los fármacos antihipertensivos es reducir la resistencia vascular mediante vasodilatación. En el presente estudio, se han examinado los efectos vasorrelajantes de los 10 principales componentes candidatos. Los resultados mostraron que los 10 componentes tienen diferentes grados de vasodilatación. Entre ellos, el ácido ferúlico, el borneol y la daidzina tuvieron fuertes efectos relajantes, lo que está de acuerdo con hallazgos anteriores (Suzuki et al., 2007; Deng et al., 2012; Silva-Filho et al., 2012; Zhao et al., 2014; Zhou et al., 2017; Santos et al., 2019). El magnolol, la artemisinina y el ácido quenodesoxicólico provocaron una relajación moderada, también consistente con los informes de los estudios anteriores (Teng et al., 1990; Li et al., 2005; Seok et al., 2012; Wang et al., 2017). Además, nuestro trabajo reportó por primera vez los efectos vasorrelajantes de cuatro compuestos herbales, liquiritina, ginsenósido Rc, bacopasida I y ginsenósido Rb2, aunque el efecto es bajo (Emax (% Phe) < 30%, Tabla 1). Curiosamente, se encontró que los efectos vasorrelajantes de algunos de estos componentes coincidían bien con los efectos farmacológicos de sus hierbas originales (ver detalles en la Tabla Suplementaria 7). Por ejemplo, el ácido ferúlico y el magnolol son componentes principales de TCM «chuanxiong» (Ligusticum chuanxiong Hort) y «houpo» (Magnolia officinalis Rehd. et Wils), respectivamente. En la teoría de la MTC, estas hierbas podrían promover la circulación de » Qi » en el cuerpo, disipar el viento y eliminar la humedad, en línea con la teoría de la vasodilatación (Liu et al., 2017). Este hallazgo sugirió que la estrategia de RMGF es un modelo adecuado para predecir los efectos vasorrelajantes de la MTC.

Los perfiles de expresión génica se pueden utilizar como firma de la actividad de un medicamento o enfermedad determinados para encontrar las conexiones entre medicamentos y enfermedades utilizando sus respuestas transcripcionales (Lamb, 2007; Subramanian et al., 2017). El método basado en el perfil de expresión se ha utilizado para el reposicionamiento de medicamentos, la predicción de objetivos y el descubrimiento de los efectos inmunomoduladores de los medicamentos (Iorio et al., 2010; Sirota et al., 2011; Kidd et al., 2016; Li et al., 2019). Con conjuntos de datosicsicos de grano más fino y a gran escala que se ponen a disposición del público, el conocimiento actual permite una delimitación más precisa del módulo biológico/red de procesos patológicos. Aquí identificamos y anotamos dos módulos genéticos relacionados con el diámetro de los vasos, PFGM y NFGM, mediante la investigación de genes involucrados en la regulación positiva y negativa del diámetro de los vasos a partir de un mapa funcional de genes a escala genómica.

El TFGMR se utiliza para caracterizar el enriquecimiento de PFGM y NFGM en los perfiles de expresión génica inducidos por componentes herbales y definir un valor de TES para cada componente herbal para medir su efecto vasorrelajante. Los efectos vasorrelajantes de los 10 principales componentes herbales candidatos se examinaron mediante experimentos ex vivo de contracción del anillo aórtico inducida por Phe. Entre ellos, seis compuestos, ácido ferúlico, borneol, magnolol, artemisinina, ácido quenodesoxicólico y daidzina, provocaron una relajación obvia (Emax (% Phe) > 50%, Tabla 1) y pueden utilizarse como posibles tratamientos para enfermedades con presión arterial alta.

Cabe señalar que, aunque el TFGMR solo probó una base de datos de productos químicos a base de hierbas, el método es adecuado para detectar cualquier producto químico cuyas acciones en los niveles de expresión génica se conocen. Además, se deben probar los compuestos candidatos para determinar sus efectos directos en la dilatación de los vasos de resistencia, que se evaluarán mediante flujometría Doppler láser en trabajos posteriores.

Declaración de disponibilidad de datos

En este estudio se analizaron conjuntos de datos disponibles públicamente. Estos datos se pueden encontrar aquí: NCBI Gene Expression Omnibus, número de acceso a la serie GEO: GSE85871.

Declaración de Ética

El estudio en animales fue revisado y aprobado por el Centro de Cuidado de Animales de Laboratorio de la Academia China de Ciencias Médicas Chinas.

Contribuciones de los autores

PL y CC diseñaron investigaciones, realizaron experimentos, analizaron datos y escribieron el manuscrito. WZ, DY y SL realizaron experimentos y recopilaron y analizaron datos. JZ y AL supervisaron el trabajo y escribieron y revisaron el manuscrito.

Financiación

Esta investigación fue apoyada por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 81703945, No. 31800678) y el Fondo de Tecnología e Innovación de la Universidad Agrícola de Shanxi (No.2016YJ17, No. 2017YJ40).

Declaración de Conflicto de Intereses

Los autores declaran que la investigación se realizó en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Material suplementario

El Material suplementario para este artículo se puede encontrar en línea en: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2019.01144/full#supplementary-material