LETRA

Neisseria meningitidis puede causar una enfermedad sistémica potencialmente mortal. El diagnóstico temprano y la intervención antimicrobiana inmediata son fundamentales para obtener resultados clínicos favorables. Se ha informado de resistencia a los antibióticos para penicilinas (1), tetraciclina (2) y sulfonamidas (3), así como quinolonas (4) y rifampicina (5).

N. meningitidis expresa dos porinas principales, PorA y PorB, que son variables antigénicamente entre cepas y dentro de una cepa, y PorA es variable de fase (conmutación aleatoria de encendido/apagado) (6). Neisseria gonorrhoeae expresa una sola porina, PorB. Los cambios en la expresión de porinas o variantes de porinas median la resistencia a los antibióticos en varias bacterias gramnegativas, incluyendo N. gonorrhoeae (7,-10). En N. meningitidis, la ausencia de PorB aumenta la resistencia a la tetraciclina y a la cefsulodina in vitro (11). No se ha notificado el papel del PorA en la resistencia a los antimicrobianos para el meningococo. Además de su papel propuesto en la evasión inmune, planteamos la hipótesis de que la expresión de PorA variable de fase puede proporcionar un mecanismo obvio para que el meningococo evada los antimicrobianos si PorA media la absorción o exclusión de antibióticos. Generamos cepas que carecen de PorA o PorB y realizamos ensayos de MIC. También probamos si la expresión alterada de PorA se selecciona por exposición a antimicrobianos durante el transcurso del ensayo de CMI.

Los genes porA y porB con secuencias de flanqueo se amplificaron a partir de la cepa MC58 de N. meningitidis y se clonaron en pGEM T-easy. La PCR inversa seguida de autoligación produjo plásmidos con deleciones internas e introdujo sitios de restricción. El casete LacZ/kanamicina (12) se clonó en el sitio SmaI introducido del alelo PorA eliminado, produciendo plásmido pPorALacZKan. Se amplificó un gen de cloranfenicol acetiltransferasa y se clonó en el sitio BglII introducido del alelo porB eliminado, en el plásmido pPorB: CAT. Las construcciones porA LacZ kan o porB::cat se transformaron en la cepa N. meningitidis ¢9 (13) para producir cepas ¢9ΔPorA y ¢9ΔPorB. El reemplazo alélico de alelos porA o porB de tipo salvaje con el alelo mutante se confirmó mediante PCR y secuenciación, así como SDS-PAGE de proteínas de membrana externa extraídas de Sarkosil (Fig. 1A).

el Análisis de la expresión de la porina durante el análisis de MIC. A) Se aislaron proteínas de membrana por extracción de Sarkosil y se separaron 10 µg en geles de acrilamida bis-Tris de 8 a 12% antes de la tinción de Coomassie. Carril 1, ¢9; carril 2, ¢9ΔPorA; carril 3, ¢9ΔPorB. B) Las muestras del último pozo que mostraban turbidez se platearon en agar BHI y se inmunoblotaron con el MAb MN14C11.6 específico de PorA.

La CIM se evaluó mediante el método de microdilución de caldo en placas de 96 pocillos (14) utilizando bacterias cultivadas durante la noche con agar BHI suplementado a 37 ° C y agitación subculturada durante aproximadamente 4 h en caldo BHI a 37°C antes de ajustar a aproximadamente 5 × 105 UFC/ml en función de la densidad óptica a 600 nm (OD600). Tras la adición de 50 µl a antibióticos diluidos en serie, se registraron CMI tras un crecimiento nocturno a 37°C (Tabla 1) como concentraciones a las que no se observó turbidez. Cada ensayo se realizó tres veces, cada vez por triplicado. Para cada tratamiento, las MIC fueron idénticas dentro y entre ensayos.

Nuestros resultados confirmaron que la pérdida de expresión meningocócica de PorB aumenta la resistencia a la tetraciclina (11). Las mutaciones en PorB también contribuyen a la resistencia a la tetraciclina en N. gonorrhoeae (9, 15). La terapia combinada recomendada para N. gonorrhoeae con resistencia múltiple incluye ceftriaxona inyectable y doxiciclina oral o azitromicina (16). En este contexto, es notable que la cepa mutante meningocócica ¢9ΔPorB tuviera una susceptibilidad reducida a la doxiciclina. Observamos una disminución de la susceptibilidad a la cefalotina para ¢9ΔPorB y también para las cefalosporinas cefotaxima y ceftazidima. Un informe anterior relacionó la mutación porcina de N. meningitidis con un aumento de la resistencia a la cefsulodina (11). En N. las variantes gonorrhoeae, asa PorB 3 también contribuyen a aumentar la resistencia a la cefalosporina (17). Nuestra confirmación de que Neisseria PorB modula la susceptibilidad a las cefalosporinas plantea la posibilidad de que la reducción de la susceptibilidad a esta clase pueda surgir clínicamente o verse facilitada por mutaciones en PorB en meningococos o gonococos.

Ya no se recomienda el uso de fluoroquinolonas para la infección gonocócica (18), y las mutaciones puntuales en PorB1b de N. gonorrhoeae contribuyen a disminuir la susceptibilidad de N. gonorrhoeae al ciprofloxacino. Los cambios en la expresión de la porina gonocócica alteran la resistencia al ciprofloxacino (19); encontramos que la mutación del PorB meningocócico también reduce la susceptibilidad al ciprofloxacino. Por el contrario, esta cepa era más susceptible a la rifampicina, la otra opción importante para la profilaxis meningocócica, tal vez a través de una arquitectura de membrana alterada, como se ha sugerido para la resistencia alterada a la rifamicina de Acinetobacter baumannii resistente a la colistina (20).

Por el contrario, no se observaron cambios en la susceptibilidad de ¢9ΔPorA en comparación con la cepa madre de PorA+ para ninguno de los antibióticos analizados (Tabla 1). Esto sugiere que el PorA no tiene un papel directo en la entrada de antimicrobianos en la célula o que existe una selección para una expresión reducida de PorA a través de la variación de fase durante el ensayo de CMI, ya sea en la cepa parental o en ¢9ΔPorB, lo que potencialmente enmascararía la entrada de antibióticos mediada por el PorA. Para evaluar esto, aislamos bacterias del pozo final en el que se observó turbidez y evaluamos la expresión de PorA mediante inmunoblotaje de colonias utilizando el anticuerpo monoclonal murino (MAb) MN14C11.6 anti-P1.7 (obtenido de NIBSC, Reino Unido). Como controles, se comparó la reactividad entre la cepa parental ¢9 y la cepa mutante de PorA ¢9ΔPorA. Esto mostró que la expresión de PorA no se alteró entre los pozos de control y después de la exposición a cualquiera de los antimicrobianos probados (ver Fig. 1B); por lo tanto, la disminución de la susceptibilidad de ¢9ΔPorB no se debe a niveles alterados de expresión de PorA.

Nuestros resultados son consistentes con informes anteriores sobre el papel de N. meningitidis PorB en la resistencia a cefalosporinas y tetraciclinas (9, 11, 15). Los paralelos con PORB1B gonocócico con respecto a la resistencia a los antibióticos son sorprendentes. La eliminación de la expresión de PorB también disminuyó la susceptibilidad meningocócica a la doxiciclina, una de las terapias recomendadas para N. gonorrhoeae con resistencia múltiple. Lo preocupante es que esto sugiere que la presión selectiva puede conducir a la aparición de variantes gonocócicas PorB con susceptibilidad reducida a la doxiciclina. Aunque solo registramos diferencias de 2 veces que, de forma aislada, es poco probable que conduzcan a fracasos del tratamiento, la sinergia de la variación de PorB con otras mutaciones tiene el potencial de expandir el espectro de resistencia meningocócica y gonocócica. No encontramos evidencia de un papel del PorA en el tránsito antimicrobiano a través de la membrana externa.