tutkittavat, kliiniset näytteet ja HLA-genotyypin määritys. Kaikki koehenkilöt, joilla oli aikaisemmin ollut verensiirto, suljettiin tutkimuksen ulkopuolelle. 32 perhettä, joilla oli ollut simplex skleroderma, otettiin palvelukseen ja tutkittiin HLA-luokan II ja I luokan alleeleille; 3 sukupolvea tutkittiin 20 perheelle ja 2 sukupolvea 12 perheelle. Kolme sukupolvea vaadittiin kaikkien lasten naisten osallistumiseen opintoihin, ja kaikkien lasten osallistuminen vaadittiin, koska mikrosimerismi saattoi näissä aineissa juontua äidistä tai lapsesta. Miesten, lasten ja koskaan raskaana olevien naisten osallistumiseen kuului 2 sukupolvea (eli kohde ja äiti). Yksi skleroderma-potilas oli kaksonen; myös terve kaksonen rekrytoitiin tutkimukseen. 33 tervettä verrokkiperhettä värvättiin, joista 22 oli 3 sukupolvea ja 11 2 sukupolvea. HLA-genotyypin määritys valmistui yhteensä 254 yksilölle: 128 skleroderma-suvuissa ja 126 verrokeissa. HLA: n haplotyyppien määritysten vahvistamiseksi otettiin mukaan joitakin muita perheenjäseniä. Tästä tietokannasta koehenkilöt valittiin jatkotutkimuksiin, kun koehenkilön äidillä oli jakamaton HLA-alleeli, joka oli HLA-spesifisten määritysten kohteena. Kaikki koehenkilöt saivat tietoisen suostumuksen Fred Hutchinson Cancer Research Centerin Institutional Review Boardin hyväksymänä.

Pbmc: t eristettiin koko heparinisoidusta verestä laimentamalla hbss: ään, minkä jälkeen Ficoll-Hypaque (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Ruotsi) gradienttisentrifugoitiin 1, 077 g / mL. Joiltakin lapsilta otettiin hiusten juurista DNA: ta HLA-tyypitystä varten edellä kuvatulla tavalla (9). Genominen DNA uutettiin PBMCs: stä Isoquick-Nukleiiniuuttopakkauksella (Orca Research Inc., Bothell, Washington, Yhdysvallat) valmistajan ohjeiden mukaan ja uudelleen suspendoitu 10 mM Tris-HCl (pH 9.0). DNA: n määrä ja puhtaus määritettiin standardispektrofotometrisin menetelmin. Joidenkin koehenkilöiden DNA: ta otettiin suoraan kokoverinäytteistä.

DNA-pohjaista tyypitystä sekvenssispesifisillä oligonukleotidianturipaneeleilla käytettiin tiettyjen alleelien tunnistamiseen DRB1 -, DRB3 -, DRB4 -, DRB5 -, DQA1-ja DQB1-lokuksissa. Drb1: n osalta ensimmäinen matalaresoluutioinen määritys määrittää DRB1-perheet DBR1*01-DRB1*14, minkä jälkeen tehdään vähintään 1 korkean resoluution määritys, jossa tunnistetaan tietyt DRB1-alleelit edellä kuvatulla tavalla (10, 11). DQA1-ja DQB1-alleelit määritettiin samankaltaisilla menetelmillä kuin edellä (9), ja niihin lisättiin uusia koettimia vastikään tunnistettujen alleelien havaitsemiseksi (12). HLA-luokan I antigeenit määritettiin tavanomaisella lymfosytotoksisuusmäärityksellä, jossa erotellaan 20 HLA-A, 30 HLA-B ja 8 HLA-Cw-antigeenia. Joillekin näytteille tehtiin sekvensointi erityisten HLA-luokan I alleelien määrittämiseksi (13). HLA-alleeli-ja antigeenimääritysten ja homotsygoottisuuden varmistamiseksi genotyypitettiin useita perheenjäseniä — mukaan lukien koehenkilöiden isät ja sisarukset, jos niitä oli saatavilla.

HLA-spesifiset PCR-alukkeet. Primer sekvenssit suunniteltiin perustuu kaikki tunnetut alleeli sekvenssit (12). Primer synteesi tehtiin Oligos jne. (Wilsonville, Oregon, Yhdysvallat). Yksi primer-sarja suunniteltiin kohdistamaan HLA-luokan I polymorfismi ja 3 kohdennettua HLA-luokan II polymorfismia. HLA-B44: n kohdentamiseksi suunniteltiin aluke, joka vahvistaa polymorfismeihin perustuvaa HLA-B-alleelien ryhmää ekson 3: n kohdissa 66, 69 ja 75 ja toista HLA-B-alleelien ryhmää ekson 3: n asemassa 229 olevan polymorfismin perusteella. Alukkeiden yhdistelmä vahvistaa erityisesti HLA-B44-alleeleita tuottaen 190 bp: n kappaleen. Kaikki DRB-spesifiset alukkeet suunniteltiin monistamaan alleeliryhmiä ekson 2: n hypervariable-alueen sekvenssipolymorfismeihin perustuen. HLA-DRB5*01: lle yksi primer vahvistaa drb5*01-alleelien ryhmää, joka perustuu polymorfismeihin kohdissa 25, 26, 31, 32 ja 38, ja toinen vahvistaa drb5*01-alleelien ryhmää, joka perustuu positioiden 215 ja 231 välisiin polymorfismeihin. Alukkeiden yhdistelmä vahvistaa erityisesti HLA-DRB5*01-alleeleita tuottaen 210 bp: n kappaleen. HLA-DRB1*04: ssä toinen primer vahvistaa drb1*04-alleelien ryhmää, joka perustuu polymorfismeihin kohdissa 25, 26, 31 ja 36, ja toinen vahvistaa drb1*04-alleelien ryhmää, joka perustuu polymorfismeihin kohdissa 97 ja 110. Alukkeiden yhdistelmä vahvistaa erityisesti DRB1*04: ää tuottaen 104 bp: n kappaleen. Drb1*04-alleelien välinen syrjintä saatiin aikaan käyttämällä edellistä aluketta yhdessä 1: n kanssa 2: sta alukkeesta, jotka erottelevat dimorfismin asemassa 258 (kodoni 86) tuottaen 263 bp: n fragmentin. HLA-DRB1*11: lle yksi primeri vahvistaa drb1*11-alleelien ryhmää, joka perustuu positioiden polymorfismeihin 25, 26, 28, 30, 31, 32, ja 35 ekson 2: sta, ja toinen primeri vahvistaa polymorfismeihin perustuvaa drb1*11-alleelien ryhmää ekson 2: n kohdissa 173 ja 174. The combination of primers specifically amplifies DRB1*11 and produces a 178-bp fragment. Primer sequences are as follows: B44-specific primers 5′-TCC GCG GGT ATG ACC AGG A-3′ and 3′-TCC AGG TAT CTG CGG AGC G-5′; DRB5*01-specific primers 5′-TTC TTG CAG CAG GAT AAG TAT-3′ and 3′-GTA GTT GTC CAC CGC GGC G-5′; DRB1*04-specific primers 5′-CCA CGT TTC TTG GAG CAG GTT AAA-3′ and 3′-GCG CAC GTA CTC CTC TTG GTG-5′; DRB1*11-specific primers 5′-CA CGT TTC TTG GAG TAC TCT AC-3′ and 5′-CTG GCT GTT CCA GTA CTC CT-5′.

HLA-specific PCR for maternal microchimerism. PCR–reaktioita suoritettiin tilavuutena 50 µL, joka sisälsi 1, 25-1, 5 µg genomista DNA: ta, 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8, 3), 50 mmol/L KCl, 1, 5 mmol MgCl2, 0, 001% wt/vol liivatetta, 260 µmol/L kutakin deoksinukleotidia, 0, 5 U Perfect Match PCR Enhancer (Stratagene, La Jolla, Kalifornia, USA), 2, 5 U AmpliTaq kulta-DNA-polymeraasia (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, California, USA), ja 20 pmol kutakin HLA-spesifistä pohjamaalia. Ultrapurevettä lisättiin, jotta lopullinen tilavuus oli 50 µL. Vahvistus kesti 5 minuuttia 96°C: ssa, 35 jaksoa 95°C: ssa 35 sekunnin ajan ja 65°C: ssa 35 sekuntia HLA-B44: ssä (58,5°C drb5*01: ssä; 72°C DRB1*04: ssä; 64,5°C DRB1*11: ssä), sitten 72°C: ssa 1 minuutin ajan ja viimeinen jatkovaihe 72°C: ssa 10 minuutin ajan. Optimaalinen vahvistus, herkkyys ja spesifisyys saavutettiin titraamalla MgCl2, ja primer pitoisuudet, määrä termosyklien, ja hehkutus lämpötila. Kaikki vahvistukset tehtiin GeneAmp System 9600-termosyklaattorilla (Perkin-Elmer Applied Biosystems). Määritysherkkyys määritettiin piikkikokeilla, joissa kohde-DNA laimennettiin sarjatuotantona ja siihen lisättiin tietty määrä Tausta-DNA: ta, joka vastaa koehenkilön alleeleita. HLA-B44-ja DRB5*01– spesifisillä PCR-määrityksillä pystyttiin havaitsemaan vähintään 1 kohdesolu 500 000 solun taustalta; HLA-DRB1*04-ja DRB1*11-spesifisillä PCR-määrityksillä pystyttiin havaitsemaan vähintään 1 kohdesolu 100 000 solun taustalta. Kuhunkin PCR-määritykseen sisältyi seuraavat kontrollit: a) positiivinen kontrolli DNA: sta solulinjasta, jossa on HLA-alleeli (0, 2–0, 5 µg); b) positiivinen kontrolli koehenkilön äidistä (0, 2–0, 5 µg); C) DNA: n negatiivinen kontrolli solulinjasta, jolla on samat HLA-alleelit kuin koehenkilöllä (1, 25 µg ja 0, 35 µg); ja d) negatiivinen kontrolli, joka koostuu kaikista PCR-reagensseista ilman DNA: ta. PCR-tuotteet elektroforisoitiin 100 V: n vakiojännitteellä 1 tunnin ajan 6%: n tai 8%: n TBE-Precast-geeleissä käyttäen Novex Xcell II-Minikennoa (Novex, San Diego, Kalifornia, USA). Jokainen geeli sisälsi positiivisen ja negatiivisen PCR-kontrollin ja 100 bp: n tikapuut (SLL-100; Gensura, Del Mar, Kalifornia, USA). Geelit värjättiin silver Stainilla (Silver Stain Plus Kit, Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, Kalifornia, USA) ja kuivattu Dryease Gel Drying Systemillä (Novex). Kokoverestä erotettua DNA: ta testattiin 4 näytteessä, joiden määrä ei riittänyt Pbmc: iden eristämiseen. Kaikki testit tehtiin kahtena kappaleena, ja useimmat näytteet analysoitiin useammin kuin kerran.

PCR varotoimenpiteet. Äärimmäistä varovaisuutta käytettiin mahdollisen PCR-kontaminaation välttämiseksi ja havaitsemiseksi. Erillisiä alueita käytettiin PBMC: n erottamiseen, genomin DNA: n erottamiseen, PCR: n asettamiseen ja vahvistamiseen sekä PCR-tuotteiden analysointiin, ja PCR-testejä tehtiin ennen ja jälkeen erillisissä laboratorioissa. Aerosolinkestävät pipettikärjet (Molecular Bio-Products Inc., San Diego, Kalifornia, Yhdysvallat) käytettiin kaikissa kokeissa, ja useita negatiivisia kontrolleja sisällytettiin kaikkiin PCR-vahvistimiin.

HLA-spesifisten PCR-tuotteiden sekvensointi. Alkuperäisen HLA-spesifisen PCR-tuotteen seitsemälle mikrolitralle tehtiin vielä 40 vahvistussykliä käyttäen alkuperäisiä termosykling-parametreja. Tämän PCR-tuotteen kolmekymmentä mikrolitraa elektroforoitiin 1,75-prosenttisessa ultrapure-agaroosigeelissä (GIBCO BRL, Grand Island, New York, USA) ja värjättiin etidiumbromidiliuoksella (0,5 µg/mL). Nauha poistettiin, eluoitiin ja puhdistettiin Qiaquick-geelin Uuttopakkauksella (QIAGEN Inc., Valencia, Kalifornia, Yhdysvallat). Puhdistettu PCR-tuote eluoitiin 30 µL: aan 10 mmol Tris-HCl: ää (pH 9.0) ja 100 ng lisättiin reaktioseokseen, joka sisälsi 8, 0 µL sekvensointireagenssin esiseosta (Thermosekenaasi; Amersham Corp., Arlington Heights, Illinois, USA) 12.5 pmol 5′ tai 3′ – pohjamaali ja 1 µL DMSO (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, Yhdysvallat). Ultrapurevettä lisättiin, jolloin lopullinen tilavuus oli 20 µL. Sekvensointireaktioseoksia kuumennettiin 96°C: n lämpötilassa 3 minuutin ajan GeneAmp System 9600-termosyklaattorissa, minkä jälkeen 25 sykliä 96°C: n lämpötilassa 10 sekunnin ajan, 50°C: n lämpötilassa 5 sekunnin ajan ja 60°C: n lämpötilassa 4 minuutin ajan. Tuloksena olevat PCR-tuotteet puhdistettiin ja elektroforoitiin kuten edellä. Sense-ja antisense-sekvenssit määritettiin kahtena kappaleena tutkittavan ja äidin HLA-spesifisille PCR-tuotteille sekä positiivisille kontrollisolulinjan PCR-tuotteille. Sekvenssianalyysi tehtiin Wisconsin-Pakettiversion 9.1 ohjelmistolla Genetics Computer Groupilta (Madison, Wisconsin, USA).

Sytospiinin liukuvalmistus ja In situ hybridisaatio. Sytospiinin liukuvalmisteet analysoitiin X–ja Y-kromosomispesifisten sekvenssien havaitsemiseksi Fred Hutchinson Cancer Research Centerin Molecular Cytogenetics Laboratoryssa kehitetyllä tekniikalla kimeerisyyden kvantitatiivista analysointia varten sukupuolisidonnaisissa kantasolusiirtopareissa (14). Urossolujen sytospiininäytteet valmistettiin sentrifugoimalla 30 000-60 000 vastaerotettua Pbmc: tä lasilevyihin, 300 µL / dia. Dioja säilytettiin kuivauskammiossa käyttöön asti. X-kromosomispesifiselle koettimelle DXZ1 (15) tehtiin nick-käännös digoksigeniinillä ja Y–kromosomispesifiselle koettimelle DYZ1 (16) nick-käännös biotiinilla. XY-koettimen seoksen lopullinen pitoisuus oli 0,5 µg/mL kutakin anturia hybridisaatiopuskurissa 50% formamidia, 2× SSC: tä (0,3 M natriumkloridia ja 0,03 M natriumsitraattia) ja 10% dekstraanisulfaattia. Sitä denaturoitiin 72°C: ssa 5 minuutin ajan, jäähdytettiin jäällä ja levitettiin liukumäelle. Dioja pilkottiin pepsiinissä (0,1 mg / mL 0: ssa.01 M HCl) 37°C: ssa 3 minuutin ajan, kiinteänä 4-prosenttisessa puskuroidussa formaliinissa 15 minuutin ajan, HUUHDELTUNA PBS: ssä, dehydratoituna etanolissa (70%, 95% ja 100%) ja ilmakuivattuna. Dioja denaturoitiin käsittelemällä 2× SSC: tä (72°C) 10 minuutin ajan, 70-prosenttista formamidia, 2× SSC: tä (72°C) 3 minuutin ajan, dehydratoitiin etanolisarjassa (-20°C) ja ilmakuivattiin. Kymmenen mikrolitraa koetin levitettiin luistin ja sitten asennettu coverslip (22 × 22 mm) suljettu kumisementillä. Sitä inkuboitiin yön yli 42°C: ssa kostutetussa kammiossa. Dioja pestiin 55-prosenttisessa formamidissa, 2× SSC: ssä (45°C) 15 minuutin ajan ja 2× SSC: ssä (huoneenlämmössä) 5 minuutin ajan. Koettimen signaalit havaittiin samanaikaisesti fluoreseiiniin kytketyllä antidigeniinillä (1:500 laimennos; Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana, USA) ja Texas red-kytketyllä avidiinilla (1:500 laimennos; Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornia, USA) 30 minuutin ajan huoneenlämmössä pimeässä. Pesun jälkeen 2× SSC ja PBS, ne asennettiin vectashield (Vector Laboratories). Dioja arvioitiin suoraan Nikon E600-epifluoresenssimikroskoopilla, jossa oli 100 W elohopealamppu, joka oli varustettu asianmukaisilla yhden, kahden ja kolmen hengen kaistanpäästösuodattimilla. Vain solut, joissa oli 2 näkyvää kromosomisignaalia, laskettiin ilman elektronista parannusta.