Extsellular matrix preparation and reology

ECM koostuu liivate-ja fibriiniverkosta. ECM: n komponenttien valmistamiseksi valmistetaan ensin 15 wt/v-prosenttista liivateliuosta (Tyyppi a, 300 bloom sian nahasta, Sigma) lisäämällä liivatejauhetta lämpimään (70 °C) dpbs: ää (1X dulbelcon fosfaattipuskuroitua suolaliuosta ilman kalsiumia ja magnesiumia). Liivateen annetaan liueta täysin sekoittaen 12 tuntia 70 °C: ssa, minkä jälkeen pH säädetään arvoon 7,5 käyttäen 1 M NaOH: ta. Liuos on steriili suodatettu ja varastoidaan 4 °C: ssa alikiintiöissä myöhempää käyttöä varten valussa (<3 kuukautta). Fibrinogeeniliuosta (50 mg / mL) valmistetaan liuottamalla kylmäkuivattua naudan veriplasmaproteiinia (Millipore) 37 °C: n lämpötilassa steriiliin DPBS: ään, jossa ei ole kalsiumia ja magnesiumia. Liuosta pidetään 37 °C: ssa sekoittamatta sitä vähintään 45 minuutin ajan, jotta se liukenee täydellisesti. Transglutaminaasi (TG) – liuos (60 mg/mL) valmistetaan liuottamalla kylmäkuivattu jauhe (Moo Gloo) DPBS: ään ilman kalsiumia ja magnesiumia ja sekoittamalla sitä varovasti 20 sekunnin ajan. tämän jälkeen liuosta pidetään 37 °C: ssa 20 minuutin ajan ja se suodatetaan steriilinä ennen käyttöä. CaCl2-kantaliuos (250 mM) valmistetaan liuottamalla CaCl2-jauhetta DPBS: ään ilman kalsiumia ja magnesiumia (Corning). Trombiinin kantaliuoksen valmistamiseksi kylmäkuivattu trombiini (Sigma Aldrich) valmistetaan käyttövalmiiksi 500 U/mL: ssa steriiliä DPBS: ää käyttäen ja säilytetään -20 °C: ssa.Trombiiniarvot sulatetaan juuri ennen käyttöä.

mustemittauksissa käytetään kontrolloitua jännitysreometriä (DHR-3, TA-Mittarit, Uusi Linna, DE), jonka halkaisija on 40 mm, kartio 2° ja levygeometria. Leikkausvarastointi (G’) ja häviö (G’) moduli mitataan taajuudella 1 Hz ja oskillatiivinen kanta (γ) 0,01. Aikapyyhkäisyt tehdään asettamalla nopeasti trombiinia sisältävä esisekoitettu ECM-liuos Peltier-levylle, jota pidetään 37 °C: ssa.

mustevalmisteet

kaksi mustetta tarvitaan perfusoitavien PT-mallien 3D-bioprintaukseen. Yksi muste, jota käytetään perfuusiosirutiivisteen luomiseen, koostuu kaksiosaisesta silikonielastomeerista (SE 1700, DOW Chemical), jossa on 10: 1 pohja katalysaattorille (painon mukaan) ja joka homogenoidaan keskipakoissekoittimella 2 min (2000 rpm, AE-310, Thinky Corp, Japani). Silikonimuste tulostetaan 2 tunnin kuluessa katalyytin sekoittumisesta. Tämä muste on ladattu ruiskuun (EFD Inc., East Providence, RI) ja sentrifugoitu ilmakuplien poistamiseksi ennen tulostusta huoneenlämmössä. Toinen muste, karkaava muste, jota käytetään tubuluksen painamiseen, koostuu 38 paino – % Pluronisesta F127: stä (Sigma) ja 100 U/mL trombiinista deionisoidussa, ultrasuodatetussa (diuf) vedessä. Karkumuste värjätään vaaleanpunaiseksi lisäämällä siihen Riskireaktoriväriä visualisointia varten Fig: ssä. 1 ja elokuva S1. Tämän musteen valmistamiseksi 40 painoprosenttista Pluronista F127-liuosta homogenoidaan vedessä ohuella sekoittimella, kunnes jauhe on täysin liuennut, ja säilytetään sen jälkeen 4 °C:ssa.ennen käyttöä 2000 U/mL trombiiniliuosta lisätään karkaavaan (Pluroniseen) musteeseen suhteessa 1: 20 ja homogenoidaan ohuella sekoittimella. Karannut muste Ladataan ruiskuun (EFD Inc., East Providence, RI) 4 °C: ssa ja sentrifugoituna mahdollisten ilmakuplien poistamiseksi. Ennen tulostusta muste tasapainotetaan huoneenlämmössä vähintään 15 minuutin ajan.

bioprinting of perfusable 3D proksimaalinen tubulus constructs

3D PT constructs are manufactured using a custom-designed, multimaterial 3D bioprinter, joka on varustettu neljällä itsenäisesti osoitettavalla tulostimella, jotka on asennettu 3-akseliselle, liikeohjatulle lastauslaiturille, jonka tilavuus on 725 mm × 650 mm × 125 mm (AGB 10000, Aerotech Inc., Pittsburgh, PA USA). Musteet on sijoitettu erillisiin ruiskutynnyreihin, joihin erikokoiset (halkaisija 50 µm–410 µm) suuttimet on kiinnitetty luer-lukolla (EFD Inc., East Providence, Ri, Yhdysvallat). Musteet suulakepuristetaan laskeumasuuttimien läpi käyttämällä ilmanpainetta (800 Ultra dispensing system, EFD Inc., East Providence, RI, USA), vaihteluväli 10-90 psi, joka vastaa tulostusnopeuksia 1 mm/S-5 cm/s. tulostamme ensin räätälöidyn perfuusiosirutiivisteen tallettamalla silikonimusteen 410 µm: n suutin läpi 50 mm × 75 mm lasilevyihin. Tiivistesuunnittelu on luotu käyttämällä mukautettua MATLAB-komentosarjaa, joka luo G-koodin lopulliselle tiivisterakenteelle. Painamisen jälkeen perfuusiosirutiiviste kovetetaan 80 °C: ssa uunissa >1 h ja säilytetään huoneenlämmössä ennen käyttöä.

3D PTs: n kuviointi perfuusiosirussa edellyttää ECM: n valamista ja karkumusteen tulostamista. Ensin syntyy ECM-liuos yhdistämällä 10 mg/mL fibrinogeeniä, 7,5 paino – % liivatetta, 2,5 mM CaCl2: ta ja 0,2 paino – % TG: tä. Liuos tasapainotetaan 37 °C: ssa 15-20 minuutin ajan ennen käyttöä ECM25: n optisen selkeyden parantamiseksi. Seuraavaksi liuos sekoitetaan nopeasti trombiinin kanssa suhteessa 500:1, jolloin lopullinen trombiinipitoisuus on 1 U/mL. 2 minuutin kuluessa 37 °C: ssa tapahtuu fibrinogeenin polymeroituminen fibriinigeeliksi. Tästä syystä ECM-liuos on valettava perfuusiosirun pohjalle välittömästi trombiinin sekoittamisen jälkeen. Tämän jälkeen ECM-peruskerroksen annetaan kuivua hieman typen alla niin, että se muodostaa tasaisen pinnan. Karkaava Pluroninen f127-muste (jossa on 100 U / mL trombiinia) painetaan ECM-peruskerrokseen mutkittelevana filmamenttina (tubulus) käyttäen kapenevaa 200 µm: n suutinta. Mukautetun Python-komentosarjan (MeCode) avulla määritetään työkalupolku G-koodissa. Heti karkaavan mustetulostuksen jälkeen silikonitiivisteen läpi liitetyt metalliset ontot perfuusiotapit joutuvat kosketuksiin painetun musteen kanssa. Tämän jälkeen muodostetaan ECM-pintakerros valamalla ECM-liuos painetun putken päälle edellä kuvatulla tavalla 1-2 mm: n tarkkuudella tiivisteseinien korkeudesta. Jos solut, kuten Hndf, on sisällytetty ECM:ään (Kuva. S5), ne sekoitetaan suoraan tasapainotusjakson jälkeen ennen trombiinin sekoittamista ja sen jälkeen valamista. Kun ylin ECM-kerros on valettu, rakenne peitetään lasilevyllä haihtumisen tai kontaminaation estämiseksi, ja sitä pidetään 37 °C: ssa 1 tunnin ajan, jotta fibriinipolymeroituminen päättyy ja TG yhdistää verkon. Tämän jälkeen konstruktio jäähdytetään 4 °C: seen 15-20 minuutiksi, jotta painetun karkumusteen nesteyttäminen tapahtuu.muste huuhdellaan laitteesta kylmäkennoalustan avulla, jolloin jäljelle jää avoimia putkiverkkoja, jotka toimivat HALUTUNA putkimaisena verkkona, joka on upotettu ECM: ään ekstratubulaarisessa ECM-tilassa olevien solujen kanssa tai ilman niitä.

tällä menetelmällä tuotimme myös 3D-arkkitehtuurit kerros kerrokselta-rakennusjärjestyksessä. Esimerkiksi jokainen yksittäinen kerros kolmikerroksisen rakenteen kuvassa. S10 on rakennettu käyttäen muokattua tulostusprotokollaa, joka sisältää aiemmin käsitellyt materiaalit ja menetelmät. Kun ensimmäiset tubulukset on painettu karkaistulla musteella, tulosteen päälle valetaan ECM-kerros, jonka annetaan geelata 20 minuuttia 37 °C: ssa, ennen kuin seuraava proksimaalinen tubuluskerros painetaan karkaantuneella musteella äskettäin geelatun kerroksen päälle. Tämä peräkkäinen rakentaminen esittelee 3D geometria ja mahdollistaa onnistuneen evakuointi kaikki kanavat itsenäisesti rakentamisen jälkeen. Vesipitoiset riskireaktorivärit perfusoidaan kanavien läpi ja kiihotetaan UV-valolla visualisointia varten.

3D-kudossirujen kokoonpanoprosessin loppuun saattamiseksi jokainen PT-konstruktio asetetaan koneistetulle ruostumattomasta teräksestä valmistetulle alustalle ja sen päälle asetetaan paksu akryylikansi. Kansi ja pohja on kiinnitetty yhteen neljällä ruuvilla muodostaen tiivisteen painetun silikonitiivisteen ympärille. Seuraavaksi steriili kaksiputkinen peristalttinen letku (PharMed BPT, sisähalkaisija 0,25 mm) täytetään väliaineella ja liitetään steriiliin suodattimeen, joka on kiinnitetty 10 ml: n ruiskun säiliöön (EFD Nordson), joka toimii väliainesäiliönä. PTEC-väliaine (joka on suunniteltu kasvua varten, joten ATCC-formulaatio plus 1% FBS, 1% aprotiniini ja 1% anti-anti), joka on tasapainotettu tasolle >3 h inkubaattorissa 37 °C: ssa, väliainesäiliöön lisätään 5% CO2 ja säiliöstä tuleva letku liitetään sirun ulostuloon (metallinen ontto perfuusiotappi). Ruiskua käytetään sitten pienen paineen kohdistamiseksi piipussa olevaan väliaineeseen, jolloin se pakotetaan astumaan kiinni olevaan letkuun ja täyttämään se kokonaan. Letkun täyttäminen väliaineella ennen sen liittämistä piiriin estää ilmakuplien pääsyn järjestelmään. Perfuusiopiirin täydentämiseksi säiliöstä tuleva silikoniputki liitetään sirun sisäänmenometalliperfuusiotappiin. Perfuusiosirun sisääntuloon ja ulostuloon lisätään letkun puristusliittimiä, jotta estetään hallitsematon virtaus, kun se irrotetaan peristalttisesta pumpusta, mikä voi vaurioittaa epiteeliä tai päästää ilmakuplia järjestelmään. Väliainesäiliö tasapainotetaan jatkuvasti inkubaattorissa vallitsevissa olosuhteissa väliainesäiliön päällä olevan steriilin suodattimen avulla.

soluviljelmä

ihmisen kuolemattomat Ptecit (RPTEC / TERT1, ATCC CRL-4031) viljellään ATCC: n ohjeiden mukaisesti ja niitä käytetään kaikissa PT-mallitutkimuksissa kohtaan 20 saakka. Geeniekspressioanalyysissä käytetään ja viljellään ihmisen primaarisia RPTEC (Cell Science) -, immortalized PTECs (RPTEC-TERT1, Evercyte) – ja a498 (ATCC HTB-44) – munuaissyöpäsoluja toimittajan ohjeiden mukaan. Ihmisen vastasyntyneen ihon fibroblastit (HNDF), GFP ilmentävät (Angio-Proteomie) viljellään toimittajan ohjeiden mukaisesti ja niitä käytetään kohtaan 15 saakka.

Geeniekspressioanalyysi

ihmisen primaariset RPTEC (Solutiede), immortalisoidut RPTEC-TERT1 (Evercyte) ja a498 (ATCC HTB-44) munuaissyöpäsolut kasvatetaan 96-kuoppaisissa levyissä toimittajan ohjeiden mukaan ja kerätään 3.päivänä konfluenssin jälkeen korvaamalla viljelyaine 100 µl / kuoppa 1x RNA-lyysiseoksella (QuantiGene Sample Processing Kit, QS0101). Tämän jälkeen 40 µl lysaattia sekoitetaan mRNA-capture-magneettiseen helmisarjaan (Panomics QuantiGene Plex Set 12631, luettelonumero 312631), inkuboidaan yön yli, käsitellään haarautunutta DNA-vahvistusta varten ja analysoidaan valmistajan ohjeiden mukaisesti (Panomics QuantiGene Plex Assay kit, QP1015). Ppib-luotainta käytetään kodinhoitogeeninä normalisointiin. Fluoresenssin Intensiteettitiedot (FI) esitetään 3 biologisen toisinnon keskiarvona ja keskihajontana.

mediaperfusaatin Sytokiinianalyysi

Mediaperfusaatti kerätään tubuluksesta 25 päivän ajan solujen kylvön jälkeen ja säilytetään -80 °C: ssa ennen analyysiä. Sytokiiniprofilointia varten supernatantit sulatetaan jäällä, laimennetaan 2x näytteen laimennuspuskurissa (Bioradiluettelo #M60-009rdpd) ja analysoidaan Luminex-teknologiapohjaisella ELISA-menetelmällä käyttäen Bio-Plex Pro™ Human Chemokine IL-6 (sarja #171bk29mr2), IL-8 (sarja #171-BK31MR2) ja MCP-1 (sarja #171-BK36MR2) ja Bio-Plex 200-järjestelmiä. (biorad) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tiedot ilmoitetaan keskimääräisinä sytokiinipitoisuuksina ja teknisten kolmikertojen keskihajonnoina.

Epithelialisaatio ja pitkittäisviljely

jokaista 3D PT-konstruktiota perfusoidaan useiden tuntien ajan ptec-väliaineella inkubaattorissa ennen solujen latautumista / kylvöä. Ptecit (PTEC/TERT1, ATCC) trypsiinoidaan viljelyastiastaan ja tiivistetään väliaineeseen ~2 × 107 solua/mL. Solususpensio ladataan sitten perfuusiosiruun ulostulon kautta(kuva. S3b, c). Kuormitettu rakenne asetetaan inkubaattoriin useita tunteja ja käännetään 180° useiden puolen tunnin välein, jotta tubuluseinämät voidaan kylvää tasaisesti, minkä jälkeen se inkuboidaan tubuluksessa ilman virtausta yön yli. Seuraavana päivänä ei-kiinnittyneet solut huuhtoutuvat ulos putkesta virtauksen vaikutuksesta painovoiman vaikutuksesta. Tämän jälkeen aloitetaan tuoreiden väliaineiden perfuusio ja jäljellä olevat solut alkavat ryhmittyä ja sitten kasvaa näistä pesäkkeistä (Kuva. S3f) kunnes ne saavuttavat confluency noin 3 viikkoa kylvön jälkeen (kuva. S3k). Kasvuvaiheen aikana Ptec: ille syötetään ATCC: n ohjeiden mukaisesti valmistettua ptec-väliainetta sekä 1% aprotiniinia (EMD Millipore, jota käytetään hidastamaan ECM: n hajoamista), 1% sikiöiden seerumia (FBS) ja 1% antibioottilääkitystä (Gibco). Kypsymisen jälkeen FBS poistetaan, ja PTECs pakkautuu tiiviiseen epiteelikerrokseen (elokuva S2). Päivänä 1 kylvön jälkeen PTECs altistetaan jatkuvalle yksisuuntaiselle virtaukselle nopeudella 1 µl/min, mikä vastaa leikkausjännityksiä, jotka vaihtelevat 0, 1-0, 5 dynes/cm2 tubuluksen poikkileikkauksesta riippuen. Väliaine syötetään peristalttisella pumpulla suljetussa kierrossa ja vaihdetaan joka 2.päivä.

albumiinin kertymätutkimus

albumiinin kertymistä arvioidaan painetuilla 3D PT-malleilla sekä 2D-kontrolleilla. Ensimmäinen kontrolli koostuu kudosviljelmämuovilla kasvatetuista PTECs: istä, kun taas toinen kontrolli koostuu ECM: llä kasvatetuista PTECs: istä. Kussakin tapauksessa Ptecit kasvatetaan konfluenssiin ja annetaan kypsyä seerumittomassa väliaineessa. Ihmisen seerumin albumiini, joka on konjugoitu FITC: llä (HSA-FITC, Abcam ab8030), suspendoidaan ptec-väliaineeseen 50 µg/mL. Kaikkia näytteitä inkuboidaan HSA-FITC: llä niiden väliaineessa 2 tunnin ajan (perfuusiossa se perfuusioidaan avoimen lumen läpi). Altistuksen jälkeen kaikki näytteet pestään 3x tilavuudella ja sitten trypsinoidaan 10x trypsiinillä yksittäisten solujen keräämiseksi. Solut ovat kiinteitä ja niiden vastapainona käytetään megalinin primaarisia ja sekundaarisia vasta-aineita (taulukossa S2 luetellaan käytetyt spesifiset vasta-aineet). Näiden näytteiden solut ja paljaat solut analysoidaan virtaussytometrialla (BD LSR Fortessa) ja tiedot kerätään N = 10 000 solusta näytettä kohti. HSA-FITC: n ja megalinin kuvien saamiseksi PTECs: ssä näytteet kiinnitetään paikoilleen formaliinilla sen sijaan, että ne trysinisoitaisiin pesuvaiheen jälkeen. Nämä näytteet torjutaan megalinin varalta ja kuvataan konfokaalimikroskopialla (Zeiss LSM710).

siklosporiini A-testi

Cysan vaikutusta sekä 2D-kontrolleihin että bioprintattuun 3D-PT: hen tutkitaan. 2D: ssä solut kylvetään 96-kuoppaisessa muodossa kudosviljelymuoviin ja kasvatetaan konfluenssiin. Heille syötetään mediaa ATCC: n ohjeiden mukaan. CysA (Sigma-Aldrich, SML1018) suspendoidaan väliaineessa eri pitoisuuksina ja inkuboidaan soluilla 24 tunnin ajan. elinkelpoisuusmääritys(3-(4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-5-(3-karboksimetoksifenyyli)-2-(4-sulfofenyyli)-2h-tetratsolium) fenatsiinimetosulfaatin (MTS) läsnä ollessa suoritetaan 24 tunnin kuluttua altistuksesta. Tämä määritys saadaan päätökseen PTECs: llä varhaisessa konfluenssissa antamalla CysA soluille päivänä, jona ne saavuttivat confluencyn, sekä myöhään confluency, antamalla CysA: lle useita päiviä sen jälkeen, kun ne saavuttivat confluencyn. Erityisesti toksisuustulokset ovat samanlaiset kussakin tapauksessa (kuva. 5n). 3D PTs: lle Cysaa syötetään eri pitoisuuksina kypsien tubulusten avoimen lumen läpi saavutettuaan confluencyn (~3 viikon kohdalla), jossa seerumia ei sisällytetä väliaineeseen vähintään 10 päivän ajan. Cysaaltistuksen jälkeen 24 tunnin kuluttua tehdään FITC-dekstraani-vuototesti (kuvattu jäljempänä), jolla arvioidaan ja kvantifioidaan PTECs-estofunktioon liittyviä häiriöitä. Suoraan tämän jälkeen PT vahvistetaan käyttämällä 10-prosenttista puskuroitua formaliinia 1 tunnin ajan ja vastapainona aktiinille ja DAPILLE (taulukossa S2 luetellaan käytetyt tahrat).

Diffuusiommeabiliteettimittaukset

epiteelin estofunktion arvioimiseksi 3D: ssä diffuusiommeabiliteetti määritetään perfusoimalla ptec-väliainetta avoimessa lumenissa, joka sisältää 25 µg/mL FITC-konjugoitua 70 kDa dekstraania (FITC-Dex, Sigma product 46945) nopeudella 15 µL/min 3 minuutin ajan ja 1 µL / min sen jälkeen ~30-45 minuutin ajan. Koko testi suoritetaan elävässä solukuvauksessa, jossa sekä tubulus että sitä ympäröivä ECM ovat näkökentässä (Kuva. S9). FITC-Dex: n diffuusiokuvio havaitaan laajakenttäisellä fluoresoivalla mikroskoopilla (Zeiss Axiovert 40 CFL). Fluoresenssikuvat otetaan ennen perfuusiota ja 3-5 minuutin välein 30-45 minuutin ajan. FITC-Dex: n Diffuusinen permeabiliteetti lasketaan kvantifioimalla fluoresenssin intensiteetin muutokset ajan mittaan käyttäen seuraavaa yhtälöä34;

PD on diffuusioperabiliteettikerroin, I1 on keskimääräinen intensiteetti alkuperäisen aikapisteen aikana, I2 on keskimääräinen intensiteetti t ~ 30-45 min, Ib on taustan intensiteetti (Kuva otettu ennen perfuusiota FITC-Dex), ja D on kanavan halkaisija. Toiset tutkijat ovat raportoineet, että PTECs voi resorboida dekstraani39, mikä johtaisi hieman korkeampiin arvoihin mitatulle diffuusioläpäisevyydelle.

olemme myös tutkineet epiteelin reunustamien tubulustemme esto-ominaisuuksia käyttäen pienimolekyylistä yhdistettä, inuliinia (4,5 kDa), jota PTECs ei resorboi eikä eritä in vivo käyttäen samaa edellä kuvattua menetelmää. Erityisesti inuliini-FITC (Sigma-tuote F3272) liuotetaan lämmitettyyn PTEC-väliaineeseen 100 µg/mL ja perfusoidaan avoimessa lumenissa nopeudella 20 µL/min 3 minuutin ajan ja 1, 5 µL/min sen jälkeen ~15 minuutin ajan. Koko testi suoritetaan elävässä solukuvauksessa, jossa sekä tubulus että sitä ympäröivä ECM ovat näkökentässä (Kuva. S7). FITC-inuliinin diffuusiokuvio havaitaan laajakenttäisellä fluoresoivalla mikroskoopilla (Leica). Fluoresenssikuvat otetaan aidatulla valonlähteellä ja liikeohjatulla vaiheella ennen perfuusiota ja 3-5 minuutin välein 15 minuutin ajan, jotta voidaan kerätä kolminkertainen tekninen mittaus.

elektronimikroskopiassa

siirtoelektronimikroskopiassa (TEM) PTECs 2D-tai 3D-arkkitehtuureissa tai terveessä ihmisen munuaiskudoksessa, joka on saatu tavanomaisesta biopsiasta ennen siirtoleikkausta, vahvistetaan käyttämällä 2, 5% glutaarialdehydiä, 1, 25% paraformaldehydiä ja 0, 03% pikriinihappoa 0, 1 M natriumkakodylaattipuskurissa (pH 7, 4) Vähintään usean tunnin ajan. Pienet näytteet (1 mm × 1 mm) poistetaan ja pestään 0,1 M kakodylaattipuskurissa ja kylvetään 1-prosenttisessa osmiumtetroksidissa (OsO4) (EMS) ja 1.5% potassiumferrosyanidia (KFeCN6) (Sigma) 1 tunnin ajan, pestään vedessä 3x ja inkuboidaan 1% vesipitoisessa uranyyliasetaatissa (EMS) 1 tunnin ajan, minkä jälkeen 2 pesua vedessä ja sen jälkeen dehydraatio eri alkoholilaaduissa (10 min kukin; 50%, 70%, 90%, 2 × 10 Vähintään 100%). Tämän jälkeen näytteet pannaan propyleenioksidiin (EMS) 1 tunnin ajan ja inkuboidaan yön yli propyleenioksidin ja TAAB-Eponin (Marivac Canada Inc. St. Laurent, Kanada). Seuraavana päivänä näytteet upotetaan TAAB Eponiin ja polymeroidaan 60 °C: ssa 48 tunnin ajan. Ultrathin-osat (noin 60 nm) leikataan Reichert Ultracut-s-mikrotomilla, asetetaan lyijysitraatilla värjättyihin kupariristikoihin ja tutkitaan JEOL 1200ex-Transmissioelektronimikroskoopilla ja kuvat tallennetaan AMT 2k CCD-kameralla. Kuva-analyysi suoritetaan ImageJ-ohjelmiston avulla.

pyyhkäisyelektronimikroskopiassa (sem) 3D: n perfusoidut Ptec-yhdisteet kiinnitetään käyttämällä 10-prosenttista puskuroitua formaliinia 1 tunnin ajan. näytteet on viipaloitu ohuesti (~1 mm paksu), jotta avointa lumenia ympäröivät solut saadaan näkyviin. Kiinnitysaine pestään pois käyttämällä PBSx2: ta ja sen jälkeen dehydraatiota eri etanolilaaduissa (20 min kukin; 30%, 50%, 70%, 90%, 3 × 20 Vähintään 100%). Näytteet asetetaan 50-prosenttiseen etanoliin ja 50-prosenttiseen heksametyylidisilatsaaniin (HMDS) 30 minuutin ajan, minkä jälkeen 100-prosenttiseen HMDS: ään 3 × 30 minuutin ajan. Kaikki vaiheet suoritetaan suljetussa ja suljetussa lasiastiassa. Hmds: llä tehdyn lopullisen pesun jälkeen näytteet poistetaan ja asetetaan N2: n alla olevaan avoimeen astiaan vetokupuun kuivumaan. Kuivatut näytteet on asennettu alumiini pin kiinnikkeet käyttämällä johtavaa hiilinauha, sputter päällystetty kullalla, ja kuvannut Tescan Vega SEM.

immunosäilyttävää

immunosäilyttävää, jota seuraa konfokaalimikroskopia, käytetään proteiinien solulokalisoitumisen arviointiin 2D-ja 3D-ptec-malleissa. Ennen immunostisointia jokainen rakenne pestään PBS: llä ja kiinnitetään sitten 20 min 1 h: iin käyttäen 10% puskuroitua formaliinia. Kiinnitysaine poistetaan pesemällä sitä useita kertoja PBS: ssä useiden tuntien ajan, minkä jälkeen se tukkeutuu yön yli käyttämällä 1 paino – % naudan seerumialbumiinia (BSA) PBS: ssä. Tärkeitä soluproteiinin tai biomarkkerin primaarisia vasta-aineita inkuboidaan konstruktioilla 1 päivän ajan taulukossa S2 luetelluissa laimennoksissa liuoksessa, jonka paino on 0, 5 paino – % BSA ja 0, 125 paino – % Triton X-100. Sitoutumattomien primaaristen vasta-aineiden poistaminen suoritetaan käyttämällä pesuvaihetta PBS: n tai 0, 5 paino – % BSA: n ja 0, 125 paino – % Triton X-100: n liuosta vastaan PBS: ssä yhden päivän ajan. Sekundaarisia vasta-aineita inkuboidaan konstruktioilla 1 päivän ajan taulukossa S2 luetelluilla laimennoksilla liuoksessa, jonka BSA on 0, 5 paino – % ja Triton X-100 0, 125 paino – % PBS: ssä. Näytteet värjätään Nucbluella tai Actingreenillä 2 tunnin ajan, minkä jälkeen ne pestään 1 päivän ajan PBS: llä ennen kuvantamista.

kuvan renderöinti ja analysointi

Vaihesopimusmikroskopia suoritetaan käänteisellä Leica DM IL-tähtäimellä, jonka tavoitteet ovat 1,25 X-40x. Konfokaalimikroskopia suoritetaan pystyasennossa olevalla Zeiss lsm 710: llä, jonka upotustavoitteet ovat 5X-40x, käyttäen spektrilasereita 405, 488, 514, 561 ja 633 nm aallonpituuksilla. Z-pinojen kuvarekonstruktiot suoritetaan ImageJ: ssä käyttäen Z-projektiofunktiota, jossa on pikselin enimmäisintensiteettiasetus. Kaikki kirkkauden lisäykset suoritetaan tasaisesti koko Z-projisoidulle kuvalle. 3D-kuvarekonstruktiot ja pyörivät Elokuvat (Movie S3) tehdään Imaris-ohjelmistolla. Uusi cytosmart (Lonza) in inkubaattorijärjestelmä käytetään kaapata time-lapse kuvantaminen (elokuva S2). Kuva-analyysi diffusionisen läpäisevyyden kvantifiointia varten suoritetaan käyttäen mukautettuja MATLAB-skriptejä, joissa käytetään aiemmin raportoituja menetelmiä34. TEM-kuvaanalyysi suoritetaan käyttäen ImageJ-ohjelmistoa mittaamaan kennon korkeutta (n ≥ 50), microvilli-tiheyttä (n ≥ 25) ja microvilli-pituutta (n ≥ 150) vähintään 3 erillisestä näytteestä kutakin tilaa varten.

tilastollinen analyysi

tiedot ilmaistaan keskiarvona ± keskihajonta. Tilastollinen analyysi suoritetaan käyttäen MATLABIA ja tilastollinen merkitsevyys määritetään arvolla p < 0.05, joka määritetään Anovalla Tukeyn moniparivertailutestillä. Eri merkitsevyystasot (p-arvot) on merkitty tähdillä ja kunkin kuviolegendan kohdalla on esitetty erityiset p-arvot.