Aptamerit ovat nousseet uudenlaiseksi kategoriaksi bioseptorien alalla niiden laajojen sovellusten ansiosta, jotka vaihtelevat biosensoinnista terapeutiikkaan. Niiden seulontaprosessista, jota kutsutaan SELEXIKSI, on raportoitu useita muunnelmia, jotka voivat tuottaa sekvenssejä, joilla on niiden lopulliseen käyttöön tarvittavat halutut ominaisuudet.

yksijuosteisen oligonukleotidikirjaston luominen

selexin ensimmäinen vaihe sisältää täysin tai osittain satunnaistettujen oligonukleotidisekvenssien synteesin, jonka reunustavat määrätyt alueet, jotka mahdollistavat näiden satunnaistettujen alueiden PCR-monistamisen, ja RNA SELEXIN tapauksessa satunnaistetun sekvenssin in vitro transkription. Vaikka Ellington ja Szostak osoittivat, että kemiallinen synteesi pystyy tuottamaan ~1015 ainutlaatuista sekvenssiä oligonukleotidikirjastoille heidän 1990-tutkielmassaan in vitro-valinnasta, he havaitsivat, että näiden syntetisoitujen oligonukleotidien monistaminen johti merkittävään poolisen monimuotoisuuden menetykseen PCR-Biasin ja syntetisoitujen fragmenttien vikojen vuoksi. Oligonukleotidipooli monistetaan ja reaktioon lisätään riittävä määrä alkukirjastoa niin, että jokaisesta yksittäisestä sekvenssistä on lukuisia kopioita, jotta stokastisista tapahtumista johtuva potentiaalisten sidossekvenssien menetys olisi mahdollisimman pieni. Ennen kuin kirjasto otetaan Targetiin inkubaatiota ja selektiivistä retentiota varten, sekvenssikirjasto on muunnettava yksijuosteisiksi oligonukleotideiksi, jotta saavutetaan rakenteellisia konformaatioita, joilla on Targetiin sitoutumisominaisuuksia.

Target incubationEdit

juuri ennen Targetin käyttöönottoa yksijuosteista oligonukleotidikirjastoa usein lämmitetään ja jäähdytetään hitaasti oligonukleotidien muuttamiseksi termodynaamisesti stabiileiksi sekundaarisiksi ja tertiäärisiksi rakenteiksi. Kun satunnaistettu kirjasto on valmistettu, sitä inkuboidaan immobilisoidulla kohteella, jotta oligonukleotidi-kohde-sidotaan. Tähän kohde-inkubaatiovaiheeseen liittyy useita näkökohtia, mukaan lukien kohde-immobilisointimenetelmä ja strategiat sitoutumattoman oligonukleotidin erottamiseksi, inkubaatioaika ja lämpötila, inkubaatiopuskuriolosuhteet ja kohde-oligonukleotidipitoisuudet. Esimerkkejä kohde-immobilisaatiomenetelmistä ovat affiniteettikromatografiakolonnit, nitroselluloosaa sitovien määritysten suodattimet ja paramagneettiset Helmet. Viime aikoina on kehitetty SELEX-reaktioita, joissa kohteena ovat kokonaiset solut, jotka laajenevat lähelle täydellistä yhtymäkohtaa ja inkuboituvat oligonukleotidikirjaston kanssa viljelmälevyillä. Inkubaatiopuskuriolosuhteita muutetaan valitun aptameerin aiotun kohteen ja halutun toiminnan perusteella. Esimerkiksi negatiivisesti varautuneiden pienten molekyylien ja proteiinien tapauksessa varausseulonnassa käytetään runsassuolaisia puskureita, jotta nukleotidit voivat lähestyä kohdetta ja lisätä tietyn sitoutumistapahtuman mahdollisuutta. Vaihtoehtoisesti, jos haluttu aptameeritoiminto on in vivo-proteiineihin tai koko soluun sitoutuminen mahdollista terapeuttista tai diagnostista käyttöä varten, inkubaatiopuskuriolosuhteet, jotka muistuttavat in vivo-plasman suolapitoisuuksia ja homeostaattisia lämpötiloja, tuottavat todennäköisemmin aptameerejä, jotka voivat sitoutua in vivo. Toinen huomio puskuriolosuhteissa on epäspesifiset kilpailijat. Jos on erittäin todennäköistä, että reaktio-olosuhteissa tapahtuu epäspesifistä oligonukleotidin retentiota, voidaan käyttää epäspesifisiä kilpailijoita, jotka ovat muita pieniä molekyylejä tai polymeerejä kuin SELEX-kirjasto, joilla on samanlaiset fysikaaliset ominaisuudet kuin kirjastoligonukleotideilla. Kohde-ja oligonukleotidien suhteellisen pitoisuuden vaihtelu voi myös vaikuttaa valittujen aptameerien ominaisuuksiin. Jos valittuun aptameeriin kohdistuva hyvä sitoutumisaffiniteetti ei ole ongelma, voidaan kohdeylimäärää käyttää lisäämään todennäköisyyttä, että ainakin osa sekvensseistä sitoutuu inkubaation aikana ja säilyy. Tämä ei kuitenkaan luo selektiivistä painetta korkeaan sitoutumisaffiniteettiin, mikä edellyttää oligonukleotidikirjaston olevan ylimitoitettu niin, että yksittäisten sekvenssien välillä on kilpailua käytettävissä olevista erityissitoutumispaikoista.

sitova sekvenssi eluointi ja amplifikaatiomedit

kun oligonukleotidikirjastoa on inkuboitu Targetin kanssa riittävän kauan, sitoutumattomat oligonukleotidit pestään immobilisoidusta kohteesta, usein inkubaatiopuskuria käyttäen, jotta erityisesti sitoutuneet oligonukleotidit säilyvät. Sitoutumattomien sekvenssien pestessä pois, erityisesti sidotut sekvenssit eluoidaan luomalla denaturointiolosuhteita, jotka edistävät oligonukleotidin kehittymistä tai sitoutumiskehityksen menetystä, mukaan lukien virtaaminen deionisoidussa vedessä, käyttämällä ureaa ja EDTA: ta sisältäviä denaturointiliuoksia tai soveltamalla suurta lämpöä ja fyysistä voimaa. Sidottujen sekvenssien eluoituessa jäljelle jääneet oligonukleotidit transriboidaan RNA: n tapauksessa DNA: han tai muunnetun emäsvalinnan tapauksessa DNA: han tai kerätään yksinkertaisesti monistamista varten DNA: n SELEKSIN tapauksessa. Nämä ELUOITUJEN sekvenssien DNA-mallit monistetaan PCR: n avulla ja muunnetaan yksijuosteisiksi DNA: ksi, RNA: ksi tai muunnelluiksi emäsoligonukleotideiksi, joita käytetään seuraavan valintakierroksen ensimmäisenä syötteenä.

ssdnaeditin saaminen

yksi selex-menettelyn kriittisimmistä vaiheista on yksijuosteisen DNA: n (ssDNA) saaminen PCR-monistusvaiheen jälkeen. Tämä toimii syötteenä seuraavan syklin, joten on erittäin tärkeää, että kaikki DNA on yksijuosteinen ja mahdollisimman vähän menetetään. Suhteellisen yksinkertaisuuden vuoksi yksi käytetyimmistä menetelmistä on biotinyloitujen käänteisalkuaineiden käyttäminen vahvistusvaiheessa, minkä jälkeen täydentävät säikeet voidaan sitoa hartsiin, jonka jälkeen toinen säie eluoidaan lipeällä. Toinen menetelmä on epäsymmetrinen PCR, jossa monistusvaihe suoritetaan ylimääräisellä eteenpäinpohjustimella ja hyvin pienellä käänteispohjustuksella, jolloin syntyy enemmän haluttua säiettä. Menetelmän haittapuolena on se, että tuote puhdistetaan kaksijuosteisesta DNA: sta (dsDNA) ja muusta PCR-reaktiossa jäljelle jääneestä aineksesta. Ei-toivotun juosteen entsymaattinen hajoaminen voidaan suorittaa merkitsemällä tämä juoste fosfaattikoodatulla primerilla, koska sen tunnistavat entsyymit kuten Lambda-eksonukleaasi. Nämä entsyymit hajottavat sitten selektiivisesti merkittyä fosfaattijuostetta jättäen komplementtijuosteen koskemattomaksi. Kaikki nämä menetelmät palauttavat noin 50-70% DNA: sta. Yksityiskohtainen vertailu on Svobodová et al: n artikkelissa. jossa näitä ja muita menetelmiä verrataan kokeellisesti. Klassisen SELEX, prosessi satunnaistetun yhden säikeinen kirjasto sukupolven, kohde inkubaatio, ja sitova sekvenssi elution ja amplification kuvattu edellä toistetaan, kunnes valtaosa säilytetty allas koostuu kohde sitovia sekvenssejä, vaikka on olemassa muutoksia ja lisäyksiä menettelyä, joita käytetään usein, joita käsitellään jäljempänä.

negatiivinen tai vastavalinta

tietyllä SELEX-menetelmällä valittujen aptameerien spesifisyyden lisäämiseksi voidaan lisätä negatiivinen valinta tai vastavalinta ennen kohdehedelmöitystä tai välittömästi sen jälkeen. Jotta poolista poistettaisiin sekvenssit, joilla on affiniteetti kohde-immobilisaatiomatriisikomponentteihin, voidaan käyttää negatiivista valintaa, jossa kirjasto inkuboidaan kohde-immobilisaatiomatriisikomponenteilla ja sitoutumattomat sekvenssit säilyvät. Negatiivista valintaa voidaan käyttää myös eliminoimaan sekvenssejä, jotka sitovat kohdemaisia molekyylejä tai soluja inkuboimalla oligonukleotidikirjastoa pienimolekyylisillä kohdeanalogeilla, ei-toivotuilla solutyypeillä tai ei-kohdeproteiineilla ja säilyttäen sitoutumattomat sekvenssit.

valintaennusteen seuranta

SELEX-reaktion etenemisen seuraamiseksi kohdesidonnaisten molekyylien määrää, joka vastaa eluoituneiden oligonukleotidien määrää, voidaan verrata oligonukleotidien arvioituun kokonaissaantiin eluoinnin jälkeen jokaisella kierroksella. Eluoitujen oligonukleotidien määrä voidaan arvioida eluutiokonsentraatioarvioilla 260 nm: n aallonpituuden absorbanssin tai oligonukleotidien fluoresoivien merkintöjen avulla. SELEX-reaktion lähestyessä loppuaan Targetia sitovan oligonukleotidikirjaston murto-osa lähestyy 100%: a siten, että eluoituneiden molekyylien lukumäärä lähestyy oligonukleotidin kokonaissyöttöarviota, mutta voi lähentyä pienempää lukua.

Caveats and considerationsEdit

jotkut SELEX-reaktiot voivat tuottaa koettimia, jotka ovat riippuvaisia primerin sitovista alueista sekundaarirakenteen muodostumisessa. On olemassa aptamer sovelluksia, joille lyhyt sekvenssi, ja siten primer katkaisu, on toivottavaa. Alkuperäisen menetelmän eteneminen mahdollistaa RNA-kirjaston jättää pois vakio primer-alueet, joita voi olla vaikea poistaa valintaprosessin jälkeen, koska ne stabiloivat sekundaarirakenteita, jotka ovat epästabiileja pelkästään satunnaisen alueen muodostuessa.