2.1 anaerobinen hengitys

hengityksen aikana erilaiset kalvoon liittyvät dehydrogenaasit hapettavat vesiliukoiset substraatit ja pelkistävät kalvossa olevan menakinonin (MK) menakinoliksi. Aerobisissa olosuhteissa elektroneja käytetään pelkistämään happea vedeksi, kun taas anaerobisissa olosuhteissa nitraatin hengityskasvun elektronit siirtyvät nitraattiin tuottamaan nitriittiä(Kuva. 5.1). Yksi merkittävä hengityksen elektronien luovuttaja on glykolyysissä ja trikarboksyylihappokierrossa tuotettu NADH+H+. Bakteerien on kuvattu katalysoivan NADH+h+: n hapettumista nad+: ksi kahdentyyppisistä kalvoihin sitoutuneista NADH-dehydrogenaaseista, NDH-I: stä ja NDH-II: sta (Yagi, 1993). NDH-I koostuu 14 alayksiköstä, joita koodaa nuo operoni Escherichia coli, ja sisältää flaviinimononukleotidia (FMN) ja useita rauta–rikkiklustereita parin elektroninsiirtoon protonipumppaukseen kalvon poikki. NDH-II koostuu yhdestä NDH-geenin koodaamasta alayksiköstä. NDH-II ei ole integraalinen kalvoproteiini, vaan se liittyy sytoplasmakalvoston sisäpuolelle. Se sisältää proteesiryhmänä flaviiniadeniinidinukleotidia (fad), eikä elektroninsiirto ole kytköksissä protonitranslokaatioon. B. subtilisin genomissa kolme geeniä, yjlD, yumB ja yutJ, koodaavat NDH-II-tyypin mahdollisia NADH-dehydrogenaaseja, kun taas B. subtilisin genomista puuttuu nuo-operoni (Kunst et al., 1997). Yjld, uudelleennimetty Ndh, koostuu 392 aminohappojäännöksestä ja osoittaa 29%: n sekvenssin E. coli-bakteerin NDH-II: lle (Bergsma, Van Dongen, & Konings, 1982). Mielenkiintoista on B: n Ndh-proteiinin määrä. subtilis löydettiin anaerobisissa olosuhteissa merkittävästi pienentyneenä (Marino, Hoffmann, Schmid, Mobitz, & Jahn, 2000). Ndh vaikuttaa olevan B. subtilisin tärkein aerobinen NADH-dehydrogenaasi, sillä ndh-geenin mutaatiossa oli aerobinen kasvuvika (Gyan, Shiohira, Sato, Takeuchi, & Sato, 2006). Samaan aikaan osoitettiin, että yjlc-ndh operonin ilmentymistä säätelee Rex-säädin, redox-tunnistava transkriptiosäädin, joka vastaa NADH/NAD+ – suhteeseen (KS.myös kohta 3.3) (Gyan et al., 2006). Sen sijaan transkriptomitutkimuksissa (E. Härtig, julkaisemattomat tulokset) yumb-geenin ilmentyminen havaittiin indusoituneeksi nitraattihengitystiloissa. On määritettävä, onko YumB: llä ja YutJ: llä NADH-dehydrogenaasiaktiivisuutta, kuten proteiinisekvenssin samankaltaisuus viittaa, ja ovatko ne merkityksellisiä nitraatin hengitystiekasvuolosuhteissa.

muiden aerobisesti hengittävien eliöiden tavoin B. subtilis omaa sukkinaattidehydrogenaasin (sdh) tai tarkemmin sukkinaatin:kinonioksidoreduktaasin, sqr (Hägerhäll, 1997). Entsyymikompleksi on olennainen osa bakteerien sytoplasmakalvostoa ja eukaryoottien sisäistä mitokondriokalvoa. Se katalysoi sukkinaatin hapettumista fumaraatiksi yhdistettynä kinonin pelkistymiseen. Entsyymi on siten toiminnallinen osa sekä sitruunahappokiertoa että hengitystieketjua (Hägerhäll, Aasa, von wachenfeldt, Hederstedt, 1992). Sqr in B. subtilis vähentää MK: ta ja siinä on kolme proteiinialayksikköä, SdhA, SdhB ja SdhC. SdhA on flavoproteiini, jossa on yksi kovalenttisesti sitoutunut villitys, joka suorittaa sukkinaatin kahden elektronin hapettumisen fumaraatiksi sytoplasmassa. SdhB sisältää kolme rauta–rikkiklusteria (, , ja), jotka toimivat elektroninsiirrossa sytokromi b558: n flaviiniryhmän ja heme b: n välillä SdhC: ssä. SdhC: llä on viisi transmembraanista α-kierteistä segmenttiä ja se ankkuroi sdhab-dimeerin solukalvon sytoplasmapuolelle ja toimii transmembraanin elektroninsiirrossa MK: lle (Hederstedt, Maguire, Waring, & Ohnishi, 1985; Matsson, Tolstoi, Aasa, & Hederstedt, 2000). Kaksi heme b-kofaktoria välittävät elektronien siirtymistä sytoplasmakalvoston läpi kalvon ulommalle puolelle, jossa MK pelkistyy ja kaksi protonia kuluu (Hederstedt, 2002). Tämä eroaa E. coli-bakteerista, jossa ubikinonin pelkistämiseksi ubikinoliksi tarkoitetut protonit kulutetaan kalvon negatiivisella puolella, mikä ei vaikuta kalvon potentiaaliin. B. subtilit ja muut basillit, kuten Bacillus megaterium-ja Bacillus cereus-kannat, voivat kasvaa oksillisissa olosuhteissa sukkinaatin ollessa hiili-ja energianlähteenä (Schirawski & Unden, 1995, 1998).

B. subtilis, B. megaterium ja B. cereus eivät kasva anaerobisissa olosuhteissa glyserolin läsnä ollessa. Yhtäpitävästi glyseroli-3-dehydrogenaasin geenit puuttuvat genomeista. B. subtiliksessa havaittiin kuitenkin glpd-geeni kalvopaikkaisen elektroninsiirtojärjestelmän aerobista muunnosta varten. Muita E. colin primaarisia dehydrogenaaseja koodaaville geeneille, kuten eri formiaattidehydrogenaaseille, hydrogenaaseille, l-laktaattidehydrogenaasille, d-aminohappodehydrogenaasille, malaatille:kinonioksidoreduktaaseille tai kinoproteiinin glukoosidehydrogenaasille, ei löydetty homologiaa. B. subtilisilla on ilmeisesti vain rajallinen joukko primaarisia elektroneja lahjoittavia dehydrogenaaseja, nimittäin NDH-II: n eri muotoja ja aerobista glyseroli-3-fosfaattidehydrogenaasia.

aerobisissa olosuhteissa elektronit siirtyvät menakinolilta sytokromi bc1-kompleksin kautta aa3-tyyppiselle sytokromi C-oksidaasille. Mikroaerofiilisessä tilassa käytetään sytokromi bd-tyyppistä menakinolioksidaasia, jolla on suuri happifiniteetti. Fumaraatti terminaalielektroniseptorina jätettiin pois useiden basillien osalta, mukaan lukien B. subtilis (Schirawski & Unden, 1995). Näin ollen B. subtilis-genomista ei löydy fumaraattireduktaasin geenejä. Muut Bacilli kannat, kuten Bacillus licheniformis ja Bacillus circulans, voi respiroida fumaraatti kuten E. coli.

anaerobisissa kasvuolosuhteissa B. subtilis siirtää elektronit yksinomaan hengitysnitraattireduktaasille. Bakteereihin luokitellaan kolme erilaista nitraattireduktaasijärjestelmää: sytoplasmaiset assimilatoriset nad (P)H-riippuvaiset nitraattireduktaasit (Nas), kalvoon sitoutuvat hengitysnitraattireduktaasit (Nar) ja periplasmiset dissimilatoriset nitraattireduktaasit (Nap). Kaikki kolme kuuluvat proteiinien DMSO-reduktaasiperheeseen ja sisältävät bis-molybdopteriini-guaniinidinukleotidin (MGD) kofaktorin (Moreno-Vivian, Cabello, Martinez-Luque, Blasco, & Castillo, 1999). B. subtilisin genomi koodaa vain hengitysnitraattireduktaasia Nar. Nar-entsyymit koostuvat tyypillisesti kolmesta alayksiköstä. Suuressa alayksikössä NarG sisältää aktiivisen kohdan MGD-kofaktorin kanssa, pienemmässä liukoisessa alayksikössä Narhissa on yksi ja kolme keskusta ja alayksikössä NarI on sytokromi b. Nar on kinolioksidaasi ja menakinolipoolissa hapetetaan sytokromi b-alayksikkö NarI. Kaksi elektronia virtaa Narin heme B: n kautta narhin rauta–rikkiklustereihin ja lopuksi sytoplasmaiseen alayksikköön Nargiin, joka pelkistää nitraatin nitriitiksi. NarJ-proteiini ei kuulu entsyymiin, vaan sitä tarvitaan kalvoon sitoutuneen entsyymin lopulliseen kokoonpanoon (Blasco, Iobbi, Ratouchniak, Bonnefoy, & Chippaux, 1990; Zakian et al., 2010). Koska kinolin hapettumispaikat periplasmassa ja nitraatin pelkistys sytosolissa ovat erilaiset, nitraattireduktaasi Nar edistää protonigradientin muodostumista (Fig. 5.1). Nar-lokus koostuu narGHJI-operonista (koodaa hengitysteiden nitraattireduktaasia), narkista (potentiaaliselle nitriittipuristusproteiinille), avoimesta lukukehyksestä ywiC (tuntematon toiminto), arfm koodaa anaerobisen hengityksen ja käymisen modulaattorin ja myös anaerobisen säätelijän FNR: n geenin (Cruz-Ramos et al., 1995; Kunst et al., 1997).

nitriitti muutetaan tämän jälkeen edelleen ammoniakiksi assimilatorisella nitriittireduktaasilla NasDE (Cruz-Ramos et al., 1995; Hoffmann, Frankenberg, Marino, & Jahn, 1998; Hoffmann et al., 1995; Nakano & Zuber, 1998). Assimilatorinen eli ammoniumia tuottava NADH-riippuvainen nitriittireduktaasi on siroheemiä sisältävä entsyymi, joka katalysoi nitriitin kuuden elektronin pelkistymistä ammoniumiksi. Nitriittireduktaasin geenit nasDE olivat osa nasDEF-operonia ja löydettiin heti nasbc-operonin alajuoksulta, joka koodaa NADH-riippuvaista nitraattireduktaasia (Nakano, Yang, Hardin, & Zuber, 1995; Ogawa et al., 1995).