LETTER

Neisseria meningitidis voi aiheuttaa mahdollisesti kuolemaan johtavan systeemisen sairauden. Varhainen diagnoosi ja nopea antimikrobinen interventio ovat kriittisiä suotuisien kliinisten tulosten kannalta. Penisilliinien (1), tetrasykliinien (2) ja sulfonamidien (3) sekä kinolonien (4) ja rifampiinin (5) antibioottiresistenssiä on raportoitu.

N. meningitidis ilmaisee kahta pääporiinia, poraa ja Porbia, jotka ovat antigeenisesti vaihtelevia kantojen välillä ja kannan sisällä, ja PorA on faasimuuttuja (satunnainen on/off-kytkentä) (6). Neisseria gonorrhoeae ilmaisee yhden porin, Porbin. Muutokset poriiniekspressiossa tai poriinimuunnoksessa välittävät antibioottiresistenssiä useissa Gramnegatiivisissa bakteereissa, mukaan lukien N. gonorrhoeae (7,-10). N. meningitidis-tutkimuksessa Porbin puuttuminen lisää resistenssiä tetrasykliinille ja kefsulodiinille in vitro (11). Poran roolia mikrobilääkeresistenssissä ei ole raportoitu meningokokkien osalta. Sen lisäksi, että se on ehdotettu rooli immuunikierrossa, oletimme, että vaihe-muuttuja PorA ilmaisu voi tarjota ilmeinen mekanismi meningokokki kiertää mikrobilääkkeiden jos PorA välittää antibioottien ottamista tai poissulkemista. Tuotimme kantoja, joista puuttui PorA tai PorB, ja teimme MIC-määrityksiä. Testasimme MIC-määrityksen aikana myös, valitseeko mikrobilääkealtistus poran muuttuneen ilmentymän.

pora-ja porB-geenit, joilla oli sivusekvenssejä, monistettiin N. meningitidis-kannasta MC58 ja kloonattiin pgem t-easyksi. Käänteinen PCR, jota seurasi itsesidonta, tuotti plasmideja, joilla oli sisäisiä poistoja, ja loi rajoituspaikkoja. LacZ / kanamycin-kasetti (12) kloonattiin poistetun PorA-alleelin introdusoituun SmaI-kohtaan, jolloin saatiin plasmidi pporalaczkania. Kloramfenikoliasetyylitransferaasigeeni monistettiin ja kloonattiin poistetun porB-alleelin bglii-kohtaan plasmidissa pPorB: CAT. PorA lacZ kan tai porB:: kissan rakenne muutettiin N. meningitidis-kannaksi ¢9 (13), jolloin saatiin kantoja ¢9ΔPorA ja 9δporb. Villin tyypin porA-tai porB-alleelien korvaaminen mutanttialleelilla varmistettiin PCR: llä ja sekvensoinnilla sekä Sarkosyylistä uutettujen ulompien kalvoproteiinien SDS-sivulla (Kuva. 1 A).

Porin-ekspression analysointi MIC-analyysin aikana. A) kalvoproteiinit eristettiin sarkosyl-uuttamalla ja 10 µg erotettiin 8-12-prosenttisilla bis-Tris-akryyliamidigeeleillä ennen Coomassie-värjäystä. Kaista 1, ¢9; kaista 2, ¢9δpora; kaista 3, ¢9ΔPorB. B) viimeisen sameutta osoittavan kaivon näytteet pinnoitettiin BHI agarilla ja immunoblokoitiin PorA-spesifisellä MAb MN14C11.6: lla.

MIC arvioitiin liemikuutiomenetelmällä 96-kuoppalevyillä (14) käyttäen bakteereja, joita kasvatettiin yön yli täydennetyllä BHI-agarilla 37°C: n lämpötilassa ja joita ravistettiin alakulttuurissa noin 4 tunnin ajan BHI-liemessä 37°C: n lämpötilassa, ennen kuin ne mukautuivat noin 5 × 105 PMY / ml: aan optisen tiheyden perusteella 600 nm: n aallonpituudella (OD600). Kun sarjalaimennettuihin antibiootteihin oli lisätty 50 µl, Mikromolekyylit kirjattiin yön yli kestäneen 37°C: n kasvun jälkeen (Taulukko 1) pitoisuuksina, joilla sameutta ei havaittu. Jokainen määritys tehtiin kolme kertaa, joka kerta kolmena kappaleena. Kunkin käsittelyn Mikrofonit olivat identtiset määritysten sisällä ja niiden välillä.

tuloksemme vahvistivat, että meningokokin aiheuttama PorB-ekspression häviäminen lisää resistenssiä tetrasykliinille (11). Porbin mutaatiot vaikuttavat myös N: N tetrasykliiniresistenssiin. gonorrhoeae (9, 15). Suositeltu yhdistelmähoito lisääntymiselle resistentille N. gonorrhoeae-bakteerille sisältää injektoitavan keftriaksonin ja oraalisen doksisykliinin tai atsitromysiinin (16). Tässä yhteydessä on huomattava, että meningokokki ¢9δporb-mutanttikannan herkkyys doksisykliinille oli heikentynyt. Havaitsimme alentunutta alttiutta kefalotiinille ¢9δporbille ja myös kefalosporiineille kefotaksiimille ja keftatsidiimille. Aiemmassa raportissa N. meningitidis PorB-mutaatio yhdistettiin kefsulodiiniresistenssin lisääntymiseen (11). In N. gonorrhoeae, PorB loop 3-muunnokset lisäävät myös kefalosporiiniresistenssiä (17). Vahvistuksemme siitä, että Neisseria PorB moduloi kefalosporiiniherkkyyttä, lisää mahdollisuutta, että herkkyyden väheneminen tähän luokkaan voi ilmetä kliinisesti tai helpottua porb: n mutaatioista joko meningokokeissa tai gonokokeissa.

fluorokinolonin käyttöä gonokokki-infektion hoidossa ei enää suositella (18), ja N. gonorrhoeae-bakteerin porb1b: n pistemutaatiot heikentävät N. gonorrhoeae-bakteerin siprofloksasiiniherkkyyttä. Gonokokkiporiinin ilmentymismuutokset muuttavat siprofloksasiiniresistenssiä (19); havaitsimme, että meningokokkiporbin mutaatio heikentää myös siprofloksasiiniherkkyyttä. Toisaalta tämä kanta oli alttiimpi rifampiinille, joka on meningokokin estolääkityksen toinen päävaihtoehto, ehkä kalvorakenteen muuttumisen vuoksi, kuten on ehdotettu kolistiiniresistentin Acinetobacter baumannii-bakteerin (20) rifamysiiniresistenssin muuttuessa.

sitä vastoin havaitsimme, että minkään tutkitun antibiootin herkkyys 9δpora-bakteeriin verrattuna ei muuttunut (Taulukko 1). Tämä viittaa siihen, että joko poralla ei ole suoraa roolia mikrobilääkkeiden pääsyssä soluun tai poran ilmentymistä voidaan vähentää vaihevaihtelun kautta MIC-määrityksen aikana, joko vanhempaisainekannassa tai in ¢9ΔPorB-määrityksessä, mikä saattaa peittää PorA-välitteisen antibiootin pääsyn soluun. Tämän arvioimiseksi eristimme bakteerit lopullisesta kaivosta, jossa sameutta havaittiin, ja arvioimme PorA-ilmentymistä yhdyskunta-immunoblottauksella anti-P1.7 hiiren monoklonaalivasta-aineella (MAB) MN14C11.6 (saatu NIBSC: stä, Yhdistyneestä kuningaskunnasta). Kontrolleina verrattiin reaktiivisuutta vanhemman kannan ¢9 ja PorA-mutantin kannan ¢9ΔPorA välillä. Tämä osoitti, että poran ilme oli muuttumaton kontrollikuoppien välillä ja mille tahansa testatulle mikrobilääkkeelle altistumisen jälkeen (ks.Kuva. 1B); siten vähentynyt herkkyys ¢9ΔPorB ei johdu muuttunut PorA expression tasot.

tuloksemme ovat yhdenmukaiset aiempien raporttien kanssa N. meningitidis PorB-bakteerin roolista kefalosporiinien ja tetrasykliinien resistenssissä (9, 11, 15). Antibioottiresistenssin suhteen yhtäläisyydet gonokokkiporb1b: n kanssa ovat silmiinpistävät. Porb-ekspression tyrmääminen vähensi myös meningokokkiherkkyyttä doksisykliinille, joka on yksi suositelluista hoidoista lisääntymiselle vastustuskykyisen N. gonorrhoeae-bakteerin hoidossa. Huolestuttavaa on, että tämä viittaa siihen, että selektiivinen paine voi johtaa gonokokin PorB-varianttien syntymiseen, jolloin doksisykliiniherkkyys on heikentynyt. Vaikka kirjasimme vain 2-kertaisia eroja, jotka eivät yksinään todennäköisesti johda hoidon epäonnistumiseen, PorB-variaation synergia muiden mutaatioiden kanssa voi laajentaa meningokokki-ja gonokokkiresistenssispektriä. Emme löytäneet todisteita poran roolista mikrobien kulkeutumisessa ulomman kalvon läpi.