RNaasi h

RNaasi H on kaikkialla esiintyvä entsyymi, joka hajottaa RNA–DNA-dupleksin RNA-juostetta. Sitä on löydetty niinkin erilaisista organismeista kuin viruksista ja ihmissoluista (Crouch and Dirksen, 1985). Eukaryoottisoluista on tunnistettu ainakin kaksi RNaasi H-luokkaa. Prokaryooteilla on havaittu useita entsyymejä, joilla on RNaasi H-aktiivisuus (Crouch and Dirksen, 1985). Vaikka RNaasi H osallistuu DNA: n replikaatioon, sillä voi olla muita rooleja solussa ja sitä löytyy sytoplasmasta sekä tumasta (Crum et al., 1988). Entsyymin pitoisuuden tumassa arvellaan kuitenkin olevan suurempi ja osa sytoplasmavalmisteissa esiintyvästä entsyymistä saattaa johtua ydinvuodosta.

RNaasi H: n tarkkoja tunnistuselementtejä ei tunneta. On kuitenkin osoitettu, että oligonukleotidit, joilla on DNA: ta muistuttavia ominaisuuksia, niinkin lyhyet kuin tetrameerit voivat aktivoida RNaasi H: ta (Donis-Keller, 1979). Muutokset sokerin vaikutuksessa RNaasi h-aktivaatioon sokerin muunnoksina, jotka johtavat RNA: n kaltaisiin oligonukleotideihin, esim.2′-fluori tai 2′-Metoksi, eivät näytä toimivan RNaasi H: n substraatteina (Sproat et al., 1989; Kawasaki ym., 1993). Muutokset sokerin suuntaamisessa emäkseen voivat myös vaikuttaa RNaasi H-aktivaatioon, koska α-oligonukleotidit eivät pysty indusoimaan RNaasi H: ta tai voivat vaatia rinnakkaista hehkutusta (Gagnor et al., 1989; Morvan ym., 1991). Lisäksi selkärangan muutokset vaikuttavat oligonukleotidien kykyyn aktivoida RNaasi H. Metyylifosfonaatit eivät aktivoi RNaasi H: ta (Maher et al., 1989; Miller, 1989). Sen sijaan fosforotioaatit ovat erinomaisia substraatteja (Cazenave et al., 1989; Mirabelli et al., 1991; Stein and Cheng, 1993). Lisäksi kimeerisiä molekyylejä on tutkittu oligonukleotideina, jotka sitoutuvat RNA: han ja aktivoivat RNaasi H: ta (Furdon et al., 1989; Quartin ym., 1989). Esimerkiksi oligonukleotidit, jotka koostuvat 2′-metoksifosfonaattien siivistä ja viiden emäksen raosta deoksioligonukleotideja, sitoutuvat kohde-RNA: han ja aktivoivat RNaasi H: ta (Furdon et al., 1989; Quartin ym., 1989). Lisäksi osoitettiin, että yksi ribonukleotidi deoksiribonukleotidien järjestyksessä riittää toimimaan substraattina RNaasi H: lle, kun se on sitoutunut sen täydentävään deoksioligonukleotidiin (Eder ja Walder, 1991).

on myös osoitettu, että on mahdollista hyödyntää kimeerisiä oligonukleotideja, jotka on suunniteltu aktivoimaan RNaasi H: ta ja joilla on suurempi affiniteetti RNA-reseptoreihin ja jotka parantavat spesifisyyttä (Giles and Tidd, 1992; Monia et al., 1993). Eräässä tutkimuksessa kohdetranskription RNaasi-h-välitteinen pilkkominen oli paljon selektiivisempää, kun metyylifosfonaatin deoksioligonukleotidisiivistä ja fosfodiesterikatkoista koostuvia deoksioligonukleotideja verrattiin täysfosfodiesterioligonukleotideihin (Giles and Tidd, 1992).

huolimatta RNaasi H: ta koskevista tiedoista ja siitä, että monet oligonukleotidit voivat aktivoida RNaasi H: ta lysaatin ja puhdistetun entsyymin määrityksissä, RNA-kohteiden rakenteellisten piirteiden roolista RNaasi H: n aktivoinnissa tiedetään vielä suhteellisen vähän (Minshull and Hunt, 1986; Gagnor et al., 1987; Walder ja Walder, 1988). Itse asiassa suora todiste siitä, että RNaasi h-aktivaatio on itse asiassa oligonukleotidien vaikutusmekanismi soluissa, on aivan viime aikoihin asti puuttunut.

laboratorioissamme tehdyt viimeaikaiset tutkimukset antavat lisävalaistusta näihin kysymyksiin, vaikkakin epäsuoraan. ISIS 1939 on 20 mer fosforotioaatti, joka täydentää ICAM-1 RNA: n 3′-kääntämättömän alueen sekvenssiä (Chiang et al., 1991). Se estää ICAM: n tuotantoa ihmisen napalaskimon endoteelisoluissa ja pohjoiset blotit osoittavat, että ICAM-1 mRNA hajoaa nopeasti. 2 ’ – Metoksi analogi ISIS 1939 näyttää suurempi affiniteetti RNA kuin fosforotioaatti, on vakaa soluissa, mutta estää ICAM-1 proteiinin tuotantoa paljon vähemmän voimallisesti kuin ISIS 1939. On todennäköistä, että ISIS 1939 horjuttaa RNA: ta ja aktivoi RNaasi h: n.sen sijaan ICAM-1-viestin translaatiokodonia täydentävä 18-mer-fosforotioaatti ISIS 1570 esti proteiinin tuotannon, mutta ei aiheuttanut RNA: n hajoamista. Siten kahdella oligonukleotidilla, jotka kykenevät aktivoimaan RNaasi H: ta, oli erilaisia vaikutuksia riippuen paikasta mRNA: ssa, johon ne sitoutuivat (Chiang et al., 1991). Suorempi osoitus siitä, että RNaasi H on todennäköisesti keskeinen tekijä monien antisense-oligonukleotidien aktiivisuudessa, saatiin tutkimuksista, joissa bcrabl mRNA: n pilkkoutumistuotteiden tunnistamiseksi fosforotioaatti-oligonukleotideilla käsitellyissä soluissa (Crooke et al., 1995).

kun otetaan huomioon kimeeristen oligonukleotidien kehittyvä rooli 3′- ja 5′-siivissä, joiden tarkoituksena on lisätä affiniteettia kohde-RNA: n ja nukleaasin stabiiliutta, sekä DNA-tyypin aukko, joka toimii RNaasi H: n substraattina, tutkimukset, joissa keskitytään erilaisten modifikaatioiden vaikutusten ymmärtämiseen entsyymin(E) n tehokkuuteen, ovat myös erittäin tärkeitä. Eräässä tällaisessa tutkimuksessa E. coli RNaasi H, olemme ilmoittaneet, että entsyymi osoittaa minimaalinen sekvenssispesifisyys ja on processive. Kun kimeerinen oligonukleotidi, jonka siivissä on 2′- muunnettuja sokereita, hybridisoitui RNA: n kanssa, ensimmäinen pilkkoutumiskohta oli RNA: n substraatin 3′-päätä lähinnä olevan Metoksi-deoksiliitoksen vieressä oleva nukleotidi. Alkunopeus pilkkoutuminen lisääntyi DNA-aukon koon kasvaessa ja entsyymin tehokkuus oli huomattavasti pienempi kimeerisellä antisense-oligonukleotidilla duplexattua RNA-kohdetta vastaan kuin täyttä DNA-tyypin oligonukleotidia vastaan (Crooke et al., 1995).

myöhemmissä tutkimuksissa olemme arvioineet antisense-oligonukleotidien vuorovaikutuksia strukturoitujen ja rakenteettomien kohteiden kanssa sekä näiden vuorovaikutusten vaikutuksia RNaasi H: hon tarkemmin (Lima and Crooke, 1997). Useiden tarttumattomien substraattien ja Michaelis-Menten-analyysien avulla pystyimme arvioimaan sekä sidontaa että pilkkoutumista. Osoitimme, että itse asiassa E. coli RNase H1 on kaksijuosteinen RNA: ta sitova proteiini. RNA-dupleksin Kd oli 1,6 µM, DNA-dupleksin Kd oli 176 µM ja yksijuosteisen DNA: n Kd oli 942 µM. Sen sijaan entsyymi pystyi pilkkomaan RNA: ta vain RNA-DNA-dupleksissa. Mikä tahansa antisensiteettilääkkeen 2′-muutos pilkkoutumiskohdassa esti pilkkoutumista, mutta merkittävä varauksen väheneminen ja 2 ’ – muutokset siedettiin sitoutumiskohdassa. Lopuksi positiivisen varauksen (esim.2’-propoksiamiinin) asettaminen antisensiteettilääkkeeseen vähensi affiniteettia ja pilkkoutumista. Olemme myös tutkineet antisense oligonukleotidin indusoimien RNA-rakenteiden vaikutuksia E. coli RNase H1: n aktiivisuuteen (Lima and Crooke, 1997). Duplex-substraatin millä tahansa rakenteella havaittiin olevan merkittävä negatiivinen vaikutus pilkkoutumisnopeuteen. Lisäksi valittujen paikkojen pilkkoutuminen estyi kokonaan, ja tämä selittyi joko molli-tai duuriuroja tai heteroduplexia halkovan RNA-silmukan aiheuttamalla steerisellä esteellä. Viime aikoina olemme kloonanneet ja ilmaisseet ihmisen RNase H1. Proteiini on homologinen E. coli RNaasi H1: lle, mutta sillä on samanlaiset ominaisuudet kuin ihmisen RNaasi h tyyppi 2: lle (Frank et al., 1994; Wu ym., 1998). Entsyymiä stimuloivat pienet MG2+ – pitoisuudet, joita suuremmat pitoisuudet estävät, ja MN2+ inhiboi Mg2+: n läsnä ollessa. Sen molekyylipaino on 33 kDa. Se on kaksijuosteinen RNA: ta sitova proteiini ja sillä on ainutlaatuiset positio-ja sekvenssiasetukset pilkkoutumiseen (Wu et al., 1999). Lisäksi ihmisen RNaasi H2 on kloonattu, mutta tähän mennessä ilmentyvän proteiinin ei ole osoitettu olevan aktiivinen (Frank et al., 1998). Aivan viime aikoina olemme raportoineet useiden ihmisen RNaasi H1: n mutaatioiden vaikutuksista entsyymin toimintaan (Wu et al., 2000). Näin ollen meillä on nyt tarvittavat välineet alkaa tutkia ihmisen RNaasi H: n roolia biologisissa ja farmakologisissa prosesseissa ja alkaa kehittää lääkkeitä, jotka on suunniteltu vuorovaikutuksessa niiden kanssa tehokkaammin.

lopuksi, ainakin RNaasi H: n aiheuttaman kohdennetun RNA: n hajoamisen osalta olemme äskettäin osoittaneet, että kohde-RNA: n määrällä, joka on 1-150 kopiota solua kohti, ei ole vaikutusta antisense-estäjien tehoon (Miraglia, 2000). Tämä johtuu siitä, että antisensiteettilääkkeen molekyylien määrä solua kohti ylittää RNA: n kopioiden määrän useilla suuruusluokilla. Näin ollen muiden tekijöiden on oltava korkoa rajoittavia.