tulokset

tutkimme villityyppisiä (WT), heterotsygoottisia v2rv31r/WT-hiiriä ja homotsygoottisia v2r31r/V2R31R-hiiriä. Mutanttihiirillä oli normaali määrä ja esiintymistiheys kypsiä pernan αβ T-soluja ja tymosyyttejä kussakin kehitysvaiheessa. Kongeenisten markkereiden puutteen vuoksi TCRß-proteiineja ei voida tunnistaa niitä koodaavasta alleelista eikä siitä, sisältävätkö ne cß1 vs. cß2-alueet. Niinpä suoritimme virtaussytometriaa käyttäen anti-V2-ja anti-V31-vasta-aineita kvantifioidaksemme soluja, jotka ilmentävät v2+ – ja V31+ TCRß-proteiineja. Määritimme CD4+-ja CD8+ – positiiviset (SP) tymosyytit, koska ne ovat kypsiä ja naiiveja αβ T-soluja. Heijastaen julkaistuja tietoja (8, 9), havaitsimme pienen osan (0,11%) soluista, jotka värjäytyivät molemmilla vasta-aineilla WT hiirillä (Kuva. 1 B ja C), mikä vastaa pientä v2+V31+ αβ T-solujen populaatiota. Havaitsimme v2r31r/WT-hiirillä näiden solujen fraktion 12, 4-kertaistuneen ja v2r31r/V2R31R-hiirillä 32, 8-kertaistuneen (Kuva. 1 B ja C). Nämä dual-TCRß+ – solujen korotetut taajuudet vastasivat V2: n ja V31: n suurempia hyödyntämisiä ilmaistuissa tcrß-ketjuissa (Kuva. 1 D–F). Nämä tiedot osoittavat, että kahden samaan alleeliin kuuluvan Vß: n RSS-laadun parantaminen lisää niiden uudelleenjärjestymistä ja siten T-solujen fraktiota, joka ilmentää kahta eri tcrß-proteiinia. Koska SP-tymosyyttien vß-repertuaari heijastaa yksittäisten vß-segmenttien rekombinaation suhteellisia tasoja (10), V31: n suosiminen V2: n sijasta paljastaa, että v31r outcompetes v2r uudelleenjärjestämiseen. Tämä voi johtua V31: n (11) suuremmasta saavutettavuudesta tai V31: n vuorovaikutuksesta dß–Jß–segmenttien kanssa ennen kuin tcrß-lokuksen supistuma sijoittaa V2: n lähelle dß-Jß-segmenttejä. Erityisesti näiden kaksois-tcrß+ – solujen lisääntyminen v2r31r/V2R31R-hiirissä verrattuna v2r31r / WT-hiiriin merkitsee sitä, että kaksi erillistä V(D)Jß-uudelleenjärjestelyä voivat edistää TCRß-ilmentymistä samasta alleelista.

selvittääksemme, voiko yksittäinen TCRß-alleeli todella tukea tcrß-proteiinien ilmentymistä kahdesta eri V(D)Jß-uudelleenjärjestelystä, analysoimme hiiriä, joissa yksi tcrß-alleeli inaktivoituu tcrß-tehostajan (Eß) poistolla (12, 13). Määritimme hiiret, joilla oli Eß-poistettu alleeli WT-alleelin vastakohtana, alleeli, jonka RSS korvasi joko V2 (V2R) tai V31 (V31R) tai molemmat (8). Havaitsimme pienen prosenttiosuuden (0,094%) V2+V31+ SP-tymosyyttejä WT/EβΔ-hiirillä (Kuva. 2 A ja B), jotka mahdollisesti edustavat harvinaista solupopulaatiota, joka ilmentää kahta eri tcrß-proteiinia samasta WT-alleelista. Siitä huolimatta havaitsimme v2+V31+ – soluja 1,9-kertaisella frekvenssillä v2r/EβΔ-hiirillä ja 4,8-kertaisella frekvenssillä v31r / EβΔ-hiirillä (Fig. 2 A ja B). Siten joko Vß RSS: n laadun parantaminen nostaa solujen fraktiota, joka ilmentää sekä v2+ – että V31+ TCRß-proteiineja. Erityisesti havaitsimme 14,4-kertaisen v2+V31 + – solujen tiheyden V2RV31R / EβΔ-hiirissä verrattuna WT / EβΔ-hiiriin (Kuva. 2 A ja B), mikä osoittaa, että kahden Vß RSSs: n laadun parantaminen lisää synergisesti sekä v2+ – että V31+ TCRß-proteiineja ilmentävien solujen prosenttiosuutta. Todellakin, poistamalla osa V31 RSS v2r alleeli (v2r31δ alleeli; Fig. 2C) vähentää dramaattisesti v2+V31+ – solujen frekvenssiä tasolle, joka on vastaava tai pienempi kuin v2r/EβΔ-hiirillä (0, 178% vs. 0, 135%; Fig. 2 A ja B). Yhdessä nämä tiedot vahvistavat, että V2R31R-alleeli edistää kahden eri tcrß-proteiinin ilmentymistä kahdesta eri V(D)Jß-uudelleenjärjestelystä yhdellä alleelilla.

tutkimuksemme osoittaa, että luontainen geneettinen mekanismi hallitsee monogeenisen TCRß: n kokoonpanoa ja ilmentymistä. Osoitamme, että huonolaatuiset Vß RSSs-geenit tekevät yhteistyötä rajoittaakseen kahden erillisen tcrß-geenien kokoamista ja ilmentymistä yhdestä alleelista. Osoitimme aiemmin, että huonolaatuinen Vß RSSs hillitsee stokastisesti Vß-rekombinaatiotaajuutta ennen takaisinkytkennän inhibitiota tcrß-geenien biallelisen kokoonpanon ja ilmentymisen vähentämiseksi (8). Nyt edelleen päätellään, että heikkolaatuinen Vß RSSs myös alentaa esiintyvyyttä, että sekä V31 että ylävirtaan vß rekombinaatio samalla alleelilla. Nämä uudelleenjärjestelyt voivat sisältää joko 1) deleetionaalisen V2–uudelleenjärjestelyn Dß1–Jß1–Cß1–klusteriin ja inversionaalisen V31–uudelleenjärjestäytymisen dß2–Jß2–Cß2–klusteriin tai 2) inversionaalisen V31–uudelleenjärjestäytymisen dß1–Jß1-Cß1-klusteriin, joka kääntää osan lokuksesta, joka sisältää dß2-Jß2-Cß2-klusterin, ja sitten inversionaalisen V2-uudelleenjärjestäytymisen dß2: een. – jß2-cß2-klusteri (7) (Kuva. 2D). Monogeenisen tcrß-kokoonpanon ja ilmaisun saavuttamiseksi tämä RSS-pohjainen geneettinen mekanismi saattaa toimia epigeneettisillä prosesseilla,joiden on katsottu pakottavan monoallelisen vß-rekombinaation. On esimerkiksi ehdotettu, että vß–segmenttien dynaaminen vuorovaikutus ydinlaminan kanssa alentaa vß-rekombinaation tehokkuutta tukahduttamalla vß-kromatiinin saatavuutta ja kromosomin silmukointia dß-Jß-klusterien ja ylävirtaan vß-segmenttien (14, 15) välillä. Tässä yhteydessä heikkolaatuinen Vß RSSs voisi pienentää todennäköisyyttä, että alleelille tapahtuu kaksi vß–uudelleenjärjestelyä, kun V31 ja ylävirtaan vß-segmentti ovat molemmat saavutettavissa ja ylävirtaan vß on loopattu dß-Jß-segmenttien läheisyyteen. Siten rsss: n ominaisuudet voivat olla nisäkkäiden tcry -, tcrδ-ja Igλ-proteiinien monogeenisen kokoonpanon ja ilmentymisen taustalla nisäkkäissä ja IG-proteiinien rustokaloissa. Lisäksi V RSSs voi samalla tavoin vaikuttaa Igk: n ja Igλ: n isotyyppiseen poissulkemiseen B-soluissa.