LETTRE

Neisseria meningitidis peut causer une maladie systémique potentiellement mortelle. Un diagnostic précoce et une intervention antimicrobienne rapide sont essentiels pour obtenir des résultats cliniques favorables. Une résistance aux antibiotiques a été rapportée pour les pénicillines (1), la tétracycline (2) et les sulfamides (3), ainsi que pour les quinolones (4) et la rifampicine (5).

N. meningitidis exprime deux porines principales, PorA et PorB, qui sont antigéniquement variables entre souches et au sein d’une souche, et PorA est variable de phase (commutation aléatoire marche/arrêt) (6). Neisseria gonorrhoeae exprime une seule porine, PorB. Les modifications de l’expression de la porine ou des porines variantes interviennent dans la résistance aux antibiotiques de plusieurs bactéries à Gram négatif, dont N. gonorrhoeae (7, -10). Chez N. meningitidis, l’absence de PorB augmente la résistance à la tétracycline et à la céfsulodine in vitro (11). Le rôle du PorA dans la résistance aux antimicrobiens n’a pas été rapporté pour le méningocoque. En plus de son rôle proposé dans l’évasion immunitaire, nous avons émis l’hypothèse que l’expression de PorA à variable de phase pourrait fournir un mécanisme évident pour que le méningocoque échappe aux antimicrobiens si le PorA médie l’absorption ou l’exclusion d’antibiotiques. Nous avons généré des souches dépourvues de PorA ou de PorB et effectué des tests MIC. Nous avons également testé si l’expression altérée du PorA était sélectionnée par l’exposition aux antimicrobiens au cours du test de la CIM.

Les gènes porA et porB avec des séquences flanquantes ont été amplifiés à partir de la souche MC58 de N. meningitidis et clonés dans pGEM T-easy. La PCR inverse suivie d’une auto-ligature a produit des plasmides avec délétions internes et introduit des sites de restriction. La cassette LacZ/kanamycine (12) a été clonée dans le site SmaI introduit de l’allèle PORA délété, donnant le plasmide pPorALacZKan. Un gène de chloramphénicol acétyltransférase a été amplifié et cloné dans le site BglII introduit de l’allèle porB délété, dans le plasmide pPorB: CAT. Les constructions porA lacZ kan ou porB::cat ont été transformées en souche ¢9 (13) de N. meningitidis pour donner des souches ¢9ΔPorA et ¢9ΔPorB. Le remplacement allélique des allèles porA ou porB de type sauvage par l’allèle mutant a été confirmé par PCR et séquençage, ainsi que par PAGE SDS de protéines de membrane externe extraites de Sarkosyl (Fig. 1 BIS).

Analyse de l’expression de la porine pendant l’analyse MIC. (A) Les protéines membranaires ont été isolées par extraction de Sarkosyle et 10 µg ont été séparés sur des gels d’acrylamide bis-Tris à 8 à 12% avant coloration de Coomassie. Voie 1, ¢9; voie 2, ¢9ΔPorA; voie 3, ¢9ΔPorB. (B) Des échantillons du dernier puits présentant une turbidité ont été plaqués sur gélose BHI et immunobloqués avec le MAb MN14C11.6 spécifique au PorA.

Les CMI ont été évaluées par la méthode de microdilution du bouillon dans des plaques à 96 puits (14) en utilisant des bactéries cultivées pendant une nuit sur gélose BHI additionnée à 37 °C et sous agitation pendant environ 4 h dans du bouillon BHI à 37 °C avant d’être ajustées à environ 5 × 105 UFC/ml sur la base de la densité optique à 600 nm (OD600). Après addition de 50 µl à des antibiotiques dilués en série, des CMI ont été enregistrées après une croissance nocturne à 37 °C (tableau 1) en tant que concentrations auxquelles aucune turbidité n’a été observée. Chaque essai a été effectué trois fois, chaque fois en triple exemplaire. Pour chaque traitement, les CMI étaient identiques à l’intérieur et entre les essais.

Nos résultats ont confirmé que la perte d’expression de la PorB méningococcique augmente la résistance à la tétracycline (11). Les mutations de PorB contribuent également à la résistance à la tétracycline dans N. gonorrhées (9, 15). La thérapie d’association recommandée pour N. gonorrhoeae résistant à la multiplication comprend la ceftriaxone injectable et la doxycycline orale ou l’azithromycine (16). Dans ce contexte, il est à noter que la souche mutante méningococcique ¢9ΔPorB avait une sensibilité réduite à la doxycycline. Nous avons noté une diminution de la sensibilité à la céphalothine pour ¢9ΔPorB et aussi pour les céphalosporines céfotaxime et ceftazidime. Un rapport précédent a établi un lien entre la mutation de N. meningitidis PorB et une résistance accrue à la cefsulodine (11). En N. les gonorrhées, les variants de la boucle PorB 3 contribuent également à une résistance accrue aux céphalosporines (17). Notre confirmation que Neisseria PorB module la sensibilité aux céphalosporines soulève la possibilité que la réduction de la sensibilité à cette classe puisse survenir cliniquement ou être facilitée par des mutations de PorB chez les méningocoques ou les gonocoques.

L’utilisation de fluoroquinolones n’est plus recommandée pour l’infection gonococcique (18), et des mutations ponctuelles dans PorB1b de N. gonorrhoeae contribuent à une diminution de la sensibilité de N. gonorrhoeae à la ciprofloxacine. Les changements d’expression de la porine gonococcique altèrent la résistance à la ciprofloxacine (19); nous avons constaté que la mutation de la PorB méningococcique entraîne également une sensibilité réduite à la ciprofloxacine. Inversement, cette souche était plus sensible à la rifampicine, l’autre choix majeur pour la prophylaxie méningococcique, peut-être par une architecture membranaire altérée, comme cela a été suggéré pour la résistance altérée à la rifamycine d’Acinetobacter baumannii résistant à la colistine (20).

En revanche, nous n’avons observé aucun changement de sensibilité de ¢9ΔPorA par rapport à la souche mère PorA+ pour l’un des antibiotiques testés (tableau 1). Cela suggère que le PorA n’a pas de rôle direct dans l’entrée d’antimicrobiens dans la cellule ou qu’il existe une sélection pour une expression réduite du PorA via une variation de phase pendant le test de la CIM, que ce soit dans la souche parentale ou dans ¢ 9ΔPorB, masquant potentiellement l’entrée d’antibiotiques médiée par le PorA. Pour évaluer cela, nous avons isolé des bactéries du puits final dans lequel la turbidité a été observée et évalué l’expression de PorA par immunoblot de colonie à l’aide de l’anticorps monoclonal murin anti-P1.7 (MAb) MN14C11.6 (obtenu auprès de NIBSC, Royaume-Uni). En tant que témoins, la réactivité a été comparée entre la souche parentale ¢9 et la souche mutante PORA ¢9ΔPorA. Cela a montré que l’expression de PorA était inchangée entre les puits témoins et après exposition à l’un des antimicrobiens testés (voir fig. 1B); ainsi, la diminution de la sensibilité de ¢9ΔPorB n’est pas due à une modification des niveaux d’expression du PorA.

Nos résultats concordent avec les rapports précédents concernant le rôle de N. meningitidis PorB dans la résistance aux céphalosporines et aux tétracyclines (9, 11, 15). Les parallèles avec le PorB1b gonococcique en ce qui concerne la résistance aux antibiotiques sont frappants. L’élimination de l’expression de la PorB a également diminué la sensibilité des méningocoques à la doxycycline, l’un des traitements recommandés pour N. gonorrhoeae résistant à la multiplication. De façon troublante, cela suggère que la pression sélective peut conduire à l’émergence de variantes de PorB gonococciques avec une sensibilité réduite à la doxycycline. Bien que nous n’ayons enregistré que des différences de 2 fois qui, isolément, ne risquent pas d’entraîner des échecs de traitement, la synergie de la variation de la PorB avec d’autres mutations a le potentiel d’élargir le spectre de résistance aux méningocoques et aux gonocoques. Nous n’avons trouvé aucune preuve d’un rôle du PorA dans le transit antimicrobien à travers la membrane externe.