A Neisseria meningitidis PorA és a PorB expresszió szerepe az antimikrobiális érzékenységben | Company Pride
LETTER
a Neisseria meningitidis potenciálisan halálos szisztémás betegséget okozhat. A korai diagnózis és az azonnali antimikrobiális beavatkozás kritikus fontosságú a kedvező klinikai eredmények szempontjából. A penicillinek (1), A tetraciklin (2) és a szulfonamidok (3), valamint a kinolonok (4) és a rifampin (5) esetében antibiotikum-rezisztenciáról számoltak be.
N. a meningitidis két fő porint, A PorA-t és a PorB-t expresszál, amelyek antigenikusan változóak a törzsek között és egy törzsön belül, a PorA pedig fázisváltozó (véletlenszerű be – /kikapcsolás) (6). A Neisseria gonorrhoeae egyetlen porint, PorB-t fejez ki. A porin expresszió vagy a variáns porinok változásai közvetítik az antibiotikum-rezisztenciát számos Gram-negatív baktériumban, beleértve az N. gonorrhoeae-t (7,-10). Az N. meningitidis esetében a porb hiánya növeli a tetraciklinnel és a cefsulodinnal szembeni rezisztenciát in vitro (11). A PorA antimikrobiális rezisztenciában betöltött szerepéről a meningococcus esetében nem számoltak be. Az immuncsalásban javasolt szerepe mellett feltételeztük, hogy a fázisváltozó PorA expresszió nyilvánvaló mechanizmust nyújthat a meningococcus számára az antimikrobiális szerek elkerülésére, ha a PorA közvetíti az antibiotikum felvételét vagy kizárását. Pora vagy PorB nélküli törzseket állítottunk elő, és MIC vizsgálatokat végeztünk. Azt is teszteltük, hogy a megváltozott PorA expressziót antimikrobiális expozíció választja-e ki a MIC vizsgálat során.
A Pora és a porb géneket az N. meningitidis mc58 törzsből amplifikálták és pgem T-easy-vé klónozták. Az inverz PCR, majd az önligáció belső delécióval járó plazmidokat eredményezett, és restrikciós helyeket vezetett be. A LacZ / kanamycin kazettát (12) klónoztuk a törölt PorA allél bevezetett SmaI helyére, így plazmid pPorALacZKan lett. Egy kloramfenikol-acetil-transzferáz gént amplifikáltunk és klónoztunk a törölt porB allél bevezetett BglII helyére, plasmid pPorB: CAT – ban. A Pora lacZ kan vagy porB::cat konstrukciók átalakultak N. meningitidis (meningitidis) törzzé, a (6) (13) – ból, így a (Z) (9) és (9) (9) (XNUMX) törzsek jöttek létre. A vad típusú porA vagy porB allélok allélpótlását a mutáns alléllel PCR-rel és szekvenálással, valamint Sarkosyl-extrahált külső membránfehérjék SDS-oldalával igazoltuk (ábra. 1A).
a porin expresszió elemzése MIC elemzés során. (A) A Membránfehérjéket Sarkosil extrakcióval izoláltuk, és 10 6G-t különítettünk el 8-12% – os bisz-trisz akrilamid géleken a Coomassie festés előtt. Az 1-es sávot, a 9. sávot; a 2-es sávot, a 9.sávot; a 3-as sávot, a 9. sávot. B) az utolsó, zavarosságot mutató kútból származó mintákat BHI agaron bevontuk, és a PorA-specifikus MAB MN14C11.6-mal immunoblotáltuk.
a MIC-t 96 lyukú lemezeken (14) tápközeg mikrodilúciós módszerrel vizsgáltuk, egy éjszakán át, kiegészített BHI agaron termesztett baktériumokat használva 37 CAC-on, majd szubkulturált rázással körülbelül 4 órán át BHI táptalajon 37 Ca-n, mielőtt körülbelül 5 105 cfu / ml-re állítottuk volna a 600 nm-es optikai sűrűség (OD600) alapján. A sorozatosan hígított antibiotikumokhoz 50 ~ ml-t adtak hozzá, a Mic-ket egy éjszakán át tartó növekedés után 37 ~ C-nél (1.táblázat) regisztrálták, mint azokat a koncentrációkat, amelyeknél nem figyeltek meg zavarosságot. Minden vizsgálatot háromszor végeztek, minden alkalommal három példányban. Az egyes kezeléseknél a Mic-k azonosak voltak a vizsgálatokon belül és a vizsgálatok között.
1. táblázat
Mic-k a vad típusú és mutáns N-re vonatkozóan. meningitidis strainsa
| Antibiotikum | MIC (µg/ml) | ||
|---|---|---|---|
| ¢9 | ¢9ΔPorA | ¢9ΔPorB | |
| Cefotaxime | 0.003125 | 0.003125 | 0.00625 |
| ceftazidim | 0,03125 | 0,03125 | 0,0625 |
| cefalotin | 0,3125 | 0,3125 | 0,625 |
| ampicillin | 0, 0625 | 0, 0625 | 0.0625 |
| karbenicillin | 0,0625 | 0,0625 | 0,0625 |
| kloxacillin | 1,25 | 1,25 | 1,25 |
| penicillin G | 0,03125 | 0,03125 | 0.03125 |
| Piperacillin | 0,03125 | 0,03125 | 0,015625 |
| tetraciklin | 0,3125 | 0,3125 | 0,625 |
| doxiciklin | 0,1875 | 0,1875 | 0.375 |
| Ciprofloxacin | 0, 003125 | 0, 003125 | 0,00625 |
| nalidixinsav | 1,25 | 1,25 | 1,25 |
| imipenem | 0,0625 | 0,0625 | 0.0625 |
| Rifampin | 0,125 | 0,125 | 0,0625 |
eredményeink megerősítették, hogy a meningococcus PorB expresszió elvesztése növeli a tetraciklinnel szembeni rezisztenciát (11). A PorB mutációi szintén hozzájárulnak az n tetraciklinnel szembeni rezisztenciához. gonorrhoeae (9, 15). A többszörösen rezisztens N. gonorrhoeae ajánlott kombinációs terápiája injekciós ceftriaxont és orális doxiciklint vagy azitromicint tartalmaz (16). Ebben az összefüggésben figyelemre méltó, hogy a meningococcus adapporb 9 adapporb mutáns törzs csökkentette a doxiciklin iránti érzékenységet. Megfigyeltük, hogy csökkent a cefalotin iránti érzékenység a (z) 6. számú korosztálynál, valamint a cefotaxim és a ceftazidim cefalosporinoknál. Egy korábbi jelentés összekapcsolta az N. meningitidis PorB mutációt fokozott cefsulodin rezisztenciával (11). N-Ben. a gonorrhoeae, a PorB loop 3 variánsok szintén hozzájárulnak a fokozott cefalosporin-rezisztenciához (17). Megerősítésünk, hogy a Neisseria PorB modulálja a cefalosporin érzékenységet felveti annak lehetőségét, hogy az erre az osztályra való érzékenység csökkenése klinikailag felmerülhet, vagy elősegítheti a porb mutációi meningococcusokban vagy gonococcusokban.
a fluorokinolon alkalmazása már nem ajánlott gonokokkusz fertőzés esetén (18), és az N. gonorrhoeae porb1b pontmutációi hozzájárulnak az N. gonorrhoeae ciprofloxacinnal szembeni csökkent érzékenységéhez. A gonokokkusz Porin expressziós változásai megváltoztatják a ciprofloxacin rezisztenciát (19); azt találtuk, hogy a meningococcus PorB mutációja szintén csökkenti a ciprofloxacin érzékenységét. Ezzel szemben ez a törzs érzékenyebb volt a rifampinra, a meningococcus profilaxis másik fő választása, talán megváltozott membránarchitektúrán keresztül, amint azt a colistin-rezisztens Acinetobacter baumannii megváltozott rifamicin-rezisztenciájára javasolták (20).
ezzel szemben a vizsgált antibiotikumok egyikénél sem tapasztaltunk változást a hajlamban a (z) 6-os számú, a PorA+ szülő törzshöz képest (1.táblázat). Ez arra utal, hogy vagy a PorA – nak nincs közvetlen szerepe az antimikrobiális szerek bejutásában a sejtbe, vagy a mic-vizsgálat során a fázisváltozáson keresztül kiválasztódik a csökkent PorA expresszió, akár a szülői törzsben, akár a 9.számú xhamsterporb-ban, potenciálisan elfedve a PorA által közvetített antibiotikum-belépést. Ennek felméréséhez baktériumokat izoláltunk a végső kútból, amelyben zavarosságot figyeltek meg, és a Pora expresszióját kolónia immunoblottolással értékeltük az anti-P1.7 egér monoklonális antitest (MAB) MN14C11.6 alkalmazásával (nibsc, Egyesült Királyság). Kontrollként a reaktivitást hasonlították össze a szülő (6) és az (9) PorA mutáns (9) törzs között. Ez azt mutatta, hogy a PorA expressziója változatlan volt a kontroll kutak között és a vizsgált antimikrobiális szerek bármelyikének való kitettség után (lásd az ábrát. 1b); így a csökkent érzékenység a következők közül: 6DC nem a megváltozott PorA expressziós szinteknek köszönhető.
eredményeink összhangban vannak az N. meningitidis PorB cefalosporinokban és tetraciklin-rezisztenciában játszott szerepéről szóló korábbi jelentésekkel (9, 11, 15). A gonokokkusz PorB1b-vel való párhuzamok az antibiotikum-rezisztencia tekintetében szembetűnőek. A PorB expresszió kiütése szintén csökkentette a meningococcus érzékenységét a doxiciklinre, amely a szaporodással szemben rezisztens N. gonorrhoeae egyik ajánlott terápiája. Zavaróan, ez arra utal, hogy a szelektív nyomás gonokokkusz kialakulásához vezethet porb variánsok csökkent doxiciklin érzékenységgel. Bár csak 2-szeres eltéréseket regisztráltunk, amelyek önmagukban nem valószínű, hogy kezelési kudarcokhoz vezetnek, a porb variáció szinergiája más mutációkkal potenciálisan kiterjesztheti a meningococcus és a gonococcus rezisztencia spektrumát. Nem találtunk bizonyítékot a PorA szerepére az antimikrobiális tranzitban a külső membránon.