resultaten

we bestudeerden wild-type (WT), heterozygote v2rv31r/WT en homozygote v2r31r/V2R31R muizen. De gemuteerde muizen hadden normale aantallen en frequenties van rijpe αβ T-cellen van de milt en thymocyten in elk ontwikkelingsstadium. Wegens het gebrek aan congenic tellers, kunnen de proteã nen van TCRß niet door het allel worden geà dentificeerd dat hen codeert, noch of zij cß1 versus cß2 gebieden omvatten. Aldus, voerden wij cytometry stroom uit gebruikend anti-V2 en anti-V31 antilichamen om cellen te kwantificeren die proteã nen v2+ en V31+ tcrß uitdrukken. We hebben CD4+ en CD8+ single-positive (SP) thymocyten onderzocht omdat het volwassen en naïeve αβ T-cellen zijn. Als gevolg van gepubliceerde gegevens (8, 9), ontdekten we een kleine fractie (0,11%) van cellen die gekleurd waren met beide antilichamen in WT muizen (Fig. 1 b en C), wat overeenkomt met een kleine populatie van V2+V31+ αβ T-cellen. We zagen een 12,4-voudige verhoogde fractie van deze cellen in v2r31r/WT muizen, en een 32,8-voudige toename in v2r31r/V2R31R muizen (Fig. 1 b en C). Deze verhoogde frequenties van dual-TCRß + cellen kwamen overeen met het grotere gebruik van V2 en V31 in uitgedrukte tcrß ketens (Fig. 1 D-F). Deze gegevens tonen aan dat het verbeteren van RSS kwaliteit van twee Vßs op hetzelfde allel hun herschikking en bijgevolg de fractie van T cellen die twee verschillende types van tcrß proteã nen uitdrukken verhoogt. Aangezien het vß-repertoire van SP thymocytes de relatieve niveaus weerspiegelt die individuele vß-segmenten recombineren (10), onthult het preferentiële gebruik van V31 boven V2 dat V31R V2R voor herschikking overtreft. Dit kan te wijten zijn aan een grotere toegankelijkheid van V31 (11) of interactie van V31 met dß–Jß segmenten voordat tcrß locus contractie plaatst V2 in de buurt van dß–Jß segmenten. Met name, impliceert de hoger dan tweevoudige verhoging van deze dual-tcrß+ cellen in v2r31r/v2r31r muizen in vergelijking met v2r31r/WT muizen dat twee verschillende v(D)jß herschikkingen aan tcrß uitdrukking van hetzelfde allel kunnen bijdragen.

om te bepalen of een enkel tcrß-allel inderdaad de expressie van tcrß-eiwitten van twee verschillende v(D)jß-herschikkingen kan ondersteunen, analyseerden we muizen waarbij één tcrß-allel geïnactiveerd wordt door deletie van de tcrß-versterker (Eß) (12, 13). We analyseerden muizen met het eß-verwijderde allel tegenover een WT-allel, een allel met een RSS-vervanging van ofwel V2 (V2R) of V31 (V31R), of beide (8). We ontdekten een klein percentage (0,094%) van V2+ V31 + SP thymocyten in WT/EβΔ muizen (Fig. 2 A en B), die mogelijk een zeldzame populatie cellen vertegenwoordigen die twee verschillende tcrß-eiwitten uit hetzelfde WT-allel tot expressie brengen. Hoe dan ook, we observeerden v2+V31+ cellen met een 1,9-voudige hogere frequentie bij V2R/EβΔ muizen en met een 4,8-voudige hogere frequentie bij v31r/EβΔ muizen (Fig. 2 A en B). Aldus, verheft het verbeteren van de kwaliteit van of vß RSS de fractie van cellen die zowel v2+ als V31+ tcrß proteã nen uitdrukken. Met name ontdekten we een 14,4-voudige verhoogde frequentie van V2+ V31 + cellen in v2rv31r/EβΔ muizen ten opzichte van WT / EβΔ muizen (Fig. 2 A en B), wat erop wijst dat het verbeteren van de kwaliteit van twee Vß RSSs synergetisch het percentage cellen verhoogt dat zowel v2+ als V31+ tcrß-eiwitten uitdrukt. Inderdaad, het verwijderen van een deel van de V31 RSS op het V2R allel (het v2r31δ allel; Fig. 2C) vermindert dramatisch de frequentie van V2+ V31 + cellen tot niveaus die gelijkwaardig of lager zijn dan die in V2R/EβΔ muizen (0,178% versus 0,135%; Fig. 2 A en B). Collectief, bevestigen deze gegevens dat het v2r31r allel uitdrukking van twee verschillende tcrß proteã nen van twee verschillende v(D)jß herschikkingen op één enkel allel bevordert.

onze studie toont aan dat een intrinsiek genetisch mechanisme monogene tcrß assemblage en expressie regelt. We laten zien dat slechte kwaliteit Vß RSSs samenwerken om assemblage en expressie van twee verschillende tcrß genen van een allel te beperken. We hebben eerder aangetoond dat slechte kwaliteit Vß RSSs stochastisch beperken vß recombinatie frequentie voordat feedback remming biallelische assemblage en expressie van tcrß genen verminderen (8). We concluderen nu verder dat lage kwaliteit Vß RSSs ook de incidentie verlagen dat zowel V31 als een upstream Vß recombineren op hetzelfde allel. Deze herschikkingen kan betrekking hebben op 1) een deletional V2 herschikking aan de Dß1–Jß1–Cß1 cluster en een inversional V31 herschikking aan de Dß2–Jß2–Cß2 cluster, of 2) een inversional V31 herschikking aan de Dß1–Jß1–Cß1 cluster, die keert een deel van de meetkundige plaats met de Dß2–Jß2–Cß2 cluster, en vervolgens een inversional V2 herschikking aan de Dß2–Jß2–Cß2 cluster (7) (Fig. 2D). Om monogene tcrß assemblage en uitdrukking te bereiken, zou dit op RSS-gebaseerde genetische mechanisme met epigenetische processen kunnen functioneren die betrokken zijn geweest om monoallelic vß recombinatie af te dwingen. Er is bijvoorbeeld voorgesteld dat de dynamische interacties van vß-segmenten met de nucleaire lamina de efficiëntie van de vß-recombinatie verlaagt door de toegankelijkheid van Vß–chromatine en de chromosoomlus tussen dß-Jß-clusters en upstream vß-segmenten te onderdrukken (14, 15). In deze context zou een slechte kwaliteit Vß RSSs de kans kunnen verkleinen dat twee vß-herschikkingen op een allel plaatsvinden wanneer V31 en een upstream vß–segment beide toegankelijk zijn en de upstream Vß in de nabijheid van dß-Jß-segmenten wordt gelusd. Aldus, kunnen de eigenschappen van RSSs monogenic assemblage en uitdrukking van zoogdieren tcry, tcrδ, en Igλ proteã nen in zoogdieren, en IG proteã nen in kraakbeenachtige vissen ten grondslag liggen. Bovendien, kan v RSSs op dezelfde manier bijdragen aan IGK en igλ isotypic uitsluiting in cellen van B.