Preparazione e reologia della matrice extracellulare

L’ECM è costituito da una rete di gelatina e fibrina. Per preparare i componenti ECM, una soluzione di gelatina 15 wt/v% (Tipo A, 300 bloom from porcine skin, Sigma) viene prima prodotta aggiungendo polvere di gelatina a una soluzione calda (70 °C) di DPBS (1X soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbelco senza calcio e magnesio). La gelatina viene lasciata sciogliere completamente mescolando per 12 h a 70 ° C, e il pH viene quindi regolato a 7,5 usando 1 M NaOH. La soluzione è filtrata sterile e immagazzinata a 4 °C in aliquote per uso successivo nella colata (<3 mesi). Una soluzione di fibrinogeno (50 mg/mL) viene prodotta sciogliendo la proteina plasmatica bovina liofilizzata (millipore) a 37 °C in DPBS sterili senza calcio e magnesio. La soluzione viene mantenuta a 37 °C senza agitazione per almeno 45 min per consentire la completa dissoluzione. La soluzione di transglutaminasi (TG) (60 mg/mL) viene preparata sciogliendo la polvere liofilizzata (Moo Gloo) in DPBS senza calcio e magnesio e mescolando delicatamente per 20 sec. La soluzione viene quindi tenuta a 37 °C per 20 min e filtrata sterile prima dell’uso. Una soluzione madre di CaCl2 (250 mm) viene preparata sciogliendo la polvere di CaCl2 in DPBS senza calcio e magnesio (Corning). Per preparare la soluzione madre di trombina, la trombina liofilizzata (Sigma Aldrich) viene ricostituita a 500 U/mL con DPBS sterile e conservata a -20 °C. Le aliquote di trombina vengono scongelate immediatamente prima dell’uso.

Per le misurazioni della reologia dell’inchiostro viene utilizzato un reometro a sollecitazione controllata (DHR-3, TA Instruments, New Castle, DE) con diametro 40 mm, geometria a cono 2° e piastra. I moduli shear storage (G’) e loss (G”) sono misurati ad una frequenza di 1 Hz e ad una deformazione oscillatoria (γ) di 0,01. I Time sweep vengono eseguiti posizionando rapidamente una soluzione ECM premiscelata contenente trombina sulla piastra di Peltier tenuta a 37 °C.

Formulazioni di inchiostro

Per la bioprinting 3D di modelli PT perfusibili sono necessari due inchiostri. Un inchiostro, che viene utilizzato per creare la guarnizione del chip di perfusione, è composto da un elastomero siliconico in due parti (SE 1700, DOW Chemical) con una base 10:1 al catalizzatore (in peso) che viene omogeneizzato utilizzando un miscelatore centrifugo per 2 min (2000 rpm, AE-310, Thinky Corp, Giappone). L’inchiostro siliconico viene stampato entro 2 ore dalla miscelazione con catalizzatore. Questo inchiostro è caricato in una siringa (EFD Inc., East Providence, RI) e centrifugato per rimuovere eventuali bolle d’aria prima della stampa a temperatura ambiente. L’altro inchiostro, un inchiostro fuggitivo utilizzato per stampare il tubulo, è composto da 38 wt% pluronico F127 (Sigma) e 100 U / mL di trombina in acqua deionizzata, ultrafiltrata (DIUF). L’inchiostro fuggitivo viene tinto di rosa attraverso l’aggiunta di un colorante reattore di rischio per la visualizzazione in Fig. 1 e Film S1. Per preparare questo inchiostro, una soluzione pluronica F127 al 40% in acqua viene omogeneizzata usando un mixer sottile fino a quando la polvere non è completamente sciolta e successivamente conservata a 4 °C. Prima dell’uso, una soluzione di trombina 2000 U/mL viene aggiunta all’inchiostro fuggitivo (Pluronico) in un rapporto di 1:20 e omogeneizzata usando un mixer sottile. L’inchiostro fuggitivo viene quindi caricato in una siringa (EFD Inc., East Providence, RI) a 4 °C e centrifugato per rimuovere eventuali bolle d’aria. Prima della stampa, questo inchiostro è equilibrato a temperatura ambiente per almeno 15 min.

Bioprinting di costrutti di tubuli prossimali 3D perfusibili

I costrutti 3D PT sono fabbricati utilizzando una bioprinter 3D multimateriale progettata su misura dotata di quattro testine di stampa indirizzabili indipendentemente montate su un cavalletto a 3 assi controllato dal movimento con un volume di costruzione di 725 mm × 650 mm × 125 mm (AGB 10000, Aerotech Inc ., Pittsburgh, PA Stati Uniti d’America). Gli inchiostri sono alloggiati in serbatoi di siringa separati a cui sono fissati ugelli di dimensioni variabili (cioè 50 µm–410 µm di diametro) tramite un luer-lock (EFD Inc., East Providence, RI, Stati Uniti d’America). Gli inchiostri vengono estrusi attraverso ugelli di deposizione applicando la pressione dell’aria (800 Ultra dispensing system, EFD Inc., East Providence, RI, USA), che vanno da 10-90 psi, corrispondenti a velocità di stampa tra 1 mm / s e 5 cm/s. Per prima cosa stampiamo la guarnizione del chip di perfusione personalizzata depositando l’inchiostro siliconico attraverso un ugello conico da 410 µm su vetrini da 50 mm × 75 mm. Il design della guarnizione viene creato utilizzando uno script MATLAB personalizzato che genera codice G per una struttura guarnizione finale. Dopo la stampa, la guarnizione del chip di perfusione viene indurita a 80 °C in un forno per >1 h e conservata a temperatura ambiente prima dell’uso.

Patterning 3D PTs all’interno del chip di perfusione richiede una combinazione di colata l’ECM e la stampa dell’inchiostro fuggitivo. Innanzitutto, la soluzione ECM viene creata combinando 10 mg/mL di fibrinogeno, 7,5 wt% di gelatina, 2,5 mM CaCl2 e 0,2 wt% TG. Questa soluzione viene poi bilanciata a 37 °C per 15-20 minuti prima dell’uso per migliorare la chiarezza ottica dell’ECM25. Successivamente, la soluzione viene rapidamente miscelata con trombina in un rapporto di 500: 1, risultando in una concentrazione finale di trombina di 1 U/mL. Entro 2 min a 37 °C, segue la polimerizzazione del fibrinogeno in gel di fibrina. Per questo motivo, la soluzione di ECM deve essere gettata sulla base del chip di perfusione immediatamente dopo la miscelazione con la trombina. Lo strato di base ECM viene quindi lasciato asciugare leggermente sotto azoto, in modo tale da formare una superficie piana. L’inchiostro F127 pluronico fuggitivo (con 100 U / ml di trombina) viene stampato sullo strato ECM di base sotto forma di un filmamento contorto (tubulo) utilizzando un ugello conico da 200 µm. Uno script Python personalizzato (MeCode) viene utilizzato per specificare il percorso utensile in G-code. Direttamente dopo la stampa a inchiostro fuggitivo, i perni di perfusione cavi metallici interfacciati attraverso la guarnizione in silicone vengono portati a contatto con l’inchiostro stampato. Uno strato superiore di ECM viene quindi formato colando la soluzione ECM sul tubulo stampato, come descritto sopra, entro 1-2 mm dall’altezza delle pareti della guarnizione. Se le celle, come HNDFs, sono incorporate nell’ECM (Fig. S5), vengono miscelati direttamente dopo il periodo di equilibrio, prima della miscelazione della trombina e della successiva fusione. Dopo che lo strato superiore di ECM è stato fuso, il costrutto è coperto con un vetrino per prevenire l’evaporazione o la contaminazione e viene tenuto a 37 °C per 1 h per consentire la polimerizzazione della fibrina di terminare e TG di reticolare la rete. Il costrutto viene quindi raffreddato a 4 °C per 15-20 minuti per liquefare l’inchiostro fuggitivo stampato, che viene scaricato dal dispositivo utilizzando supporti a celle fredde, lasciando dietro di sé condotti aperti che fungono da rete tubolare desiderata incorporata all’interno dell’ECM con o senza celle nello spazio ECM extratubulare.

Utilizzando questo metodo, abbiamo anche prodotto architetture 3D in una sequenza di build layer-by-layer. Ad esempio, ogni singolo strato della struttura a tre strati mostrato in Fig. S10 è stato costruito utilizzando un protocollo di stampa modificato che incorpora i materiali e i metodi precedentemente discussi. Dopo aver stampato i primi tubuli con inchiostro fuggitivo, uno strato di ECM viene gettato sopra la stampa e lasciato gelare 20 min a 37 °C prima che il successivo strato di tubulo prossimale venga stampato con inchiostro fuggitivo sopra lo strato gelificato di recente. Questa costruzione successiva introduce la geometria 3D e consente l’evacuazione di tutti i canali in modo indipendente dopo la costruzione. I coloranti del reattore a rischio a base acquosa vengono perfusi attraverso i canali ed eccitati con luce UV per la visualizzazione.

Per completare il processo di assemblaggio del chip tissue 3D, ogni costrutto PT viene posizionato su una base in acciaio inossidabile lavorato e un coperchio acrilico spesso viene posizionato sopra. Il coperchio e la base sono fissati insieme da quattro viti, formando una guarnizione attorno alla guarnizione in silicone stampata. Successivamente, il tubo peristaltico sterile a due fermate (PharMed BPT, diametro interno 0,25 mm) viene riempito con supporti e collegato all’uscita di un filtro sterile collegato a un cilindro della siringa da 10 ml (EFD Nordson), che funge da serbatoio del supporto. Supporti PTEC (progettati per la crescita, quindi formulazione ATCC più 1% FBS, 1% aprotinina e 1% anti-anti) che sono stati equilibrati per >3 h in un incubatore a 37 °C, il 5% di CO2 viene aggiunto al serbatoio del supporto e il tubo dal serbatoio è collegato all’uscita del chip (perno di perfusione cavo metallico). Una siringa viene quindi utilizzata per esercitare una leggera pressione sul supporto nella canna, costringendolo ad entrare e riempire completamente il tubo collegato. Il riempimento del tubo con i media prima di collegarlo al circuito impedisce l’introduzione di bolle d’aria nel sistema. Per completare il circuito di perfusione, il tubo di silicone dal serbatoio è collegato al perno di perfusione metallica di ingresso sul chip. I morsetti di presa del tubo flessibile vengono aggiunti all’ingresso e all’uscita del chip di perfusione per impedire il flusso incontrollato quando scollegato dalla pompa peristaltica, che può danneggiare l’epitelio o consentire alle bolle d’aria di entrare nel sistema. Il serbatoio di media è sempre equilibrato con le condizioni atmosferiche nell’incubatore per mezzo di un filtro sterile sulla parte superiore del serbatoio di media.

Coltura cellulare

I PTEC immortalati dall’uomo (RPTEC / TERT1, ATCC CRL-4031) sono coltivati secondo le istruzioni di ATCC e vengono utilizzati per tutti gli studi sui modelli PT fino al passaggio 20. Per l’analisi dell’espressione genica, le cellule tumorali renali primarie umane RPTEC (Cell Science), immortalate PTECs (RPTEC-TERT1, Evercyte) e A498 (ATCC HTB-44) vengono utilizzate e coltivate secondo le istruzioni del fornitore. I fibroblasti dermici neonatali umani (HNDF), GFP che esprimono (Angio-Proteomie) sono coltivati secondo le istruzioni del fornitore e utilizzati fino al passaggio 15.

Analisi dell’espressione genica

Le cellule tumorali renali primarie umane RPTEC (Cell Science), immortalate RPTEC-TERT1 (Evercyte) e A498 (ATCC HTB-44) vengono coltivate in piastre a 96 pozzetti secondo le istruzioni del fornitore e raccolte al giorno 3 post-confluenza sostituendo il terreno di coltura con 100 µl / pozzetto di miscela di lisi di RNA 1x (QuantiGene Sample Processing Kit, QS0101). Quindi 40 µl di lisato vengono miscelati con un set di perle magnetiche a cattura di mRNA (Panomics QuantiGene Plex Set 12631, numero di catalogo 312631), incubati durante la notte, elaborati per l’amplificazione del DNA ramificato e analizzati secondo le istruzioni del produttore (Panomics QuantiGene Plex Assay kit, QP1015). La sonda PPIB viene utilizzata come gene di pulizia per la normalizzazione. I dati sull’intensità di fluorescenza (FI) sono presentati come deviazione media e standard di 3 repliche biologiche.

Analisi delle citochine del perfusato dei supporti

Il perfusato dei supporti viene raccolto da un tubulo per un periodo di 25 giorni dopo la semina cellulare e conservato a -80 °C prima dell’analisi. Per la profilazione delle citochine, i supernatanti vengono scongelati su ghiaccio, diluiti 2 volte nel tampone di diluizione del campione (catalogo BioRad #M60-009RDPD) e analizzati mediante ELISA basata sulla tecnologia Luminex utilizzando la chemochina umana Bio-Plex Pro™ IL-6 (Set #171BK29MR2), IL-8 (Set #171-BK31MR2) e MCP-1 (Set #171-BK36MR2) Sistemi (BioRad) secondo le istruzioni del produttore. I dati sono riportati come concentrazioni medie di citochine e deviazioni standard dei triplicati tecnici.

Epitelizzazione e coltura longitudinale

Ogni costrutto PT 3D viene perfuso per diverse ore con supporti PTEC nell’incubatore prima del caricamento / semina delle cellule. I PTEC (PTEC / TERT1, ATCC) sono tripsinizzati dal loro piatto di coltura e concentrati in media a ~2 × 107 cellule/mL. La sospensione della cella viene quindi caricata nel chip di perfusione attraverso l’uscita (Fig. S3b, c). Il costrutto caricato è disposto lateralmente nell’incubatore per parecchie ore ed è capovolto 180° nel corso di intervalli multipli di mezz’ora per tenere conto la semina uniforme delle pareti del tubulo, quindi incubato nel tubulo senza flusso durante la notte. Il giorno dopo, le cellule non aderenti vengono espulse dal tubulo sotto flusso per gravità. Viene quindi avviata la perfusione di mezzi freschi e le cellule rimanenti iniziano a raggrupparsi e quindi a crescere da quelle colonie (Fig. S3f) fino a raggiungere la confluenza a circa 3 settimane dopo la semina (Fig. S3k). Durante la fase di crescita, i PTEC sono alimentati con mezzi PTEC preparati secondo le linee guida ATCC più l ‘1% di aprotinina (EMD Millipore, usato per rallentare la degradazione dell’ECM), l’ 1% di siero bovino fetale (FBS) e l ‘ 1% di antibiotico-antimicotico (Gibco). Dopo la maturazione, l’FBS viene rimosso e i PTEC vengono imballati in un monostrato epiteliale stretto (Film S2). Al giorno 1 dopo la semina, i PTEC sono esposti a un flusso continuo e unidirezionale a 1 µl / min, pari a sollecitazioni di taglio che variano tra 0,1 e 0,5 dynes / cm2 a seconda della sezione trasversale del tubulo. Media viene alimentato tramite una pompa peristaltica in un circuito ad anello chiuso e cambiato ogni 2 giorni.

Studio sull’assorbimento di albumina

L’assorbimento di albumina è valutato per i modelli stampati 3D PT e per i controlli 2D. Il primo controllo è costituito da PTECs coltivati su plastica di coltura tissutale, mentre il secondo controllo è costituito da PTECS coltivati sul nostro ECM. In ogni caso, i PTEC sono cresciuti fino alla confluenza e hanno permesso di maturare in mezzi privi di siero. L’albumina sierica umana coniugata con FITC (HSA-FITC, Abcam ab8030) è sospesa in mezzi PTEC a 50 µg/mL. Tutti i campioni vengono incubati con HSA-FITC nei loro supporti per 2 h (in caso di perfusione, viene perfuso attraverso il lume aperto). Dopo l’esposizione, tutti i campioni vengono lavati con volume 3x e quindi tripsinizzati con tripsina 10x per raccogliere le singole cellule. Le cellule sono fisse e contrastate con anticorpi primari e secondari per megalin (la tabella S2 elenca gli anticorpi specifici utilizzati). Le cellule di questi campioni e le cellule nude vengono analizzate mediante citometria a flusso (BD LSR Fortessa) e i dati vengono raccolti da n = 10.000 cellule per campione. Per ottenere immagini di HSA-FITC e megalin in PTECs, i campioni vengono fissati in posizione con formalina invece di essere trysinized dopo la fase di lavaggio. Questi campioni sono counterstained per megalin e imaged utilizzando microscopia confocale (Zeiss LSM710).

Ciclosporina A test

L’effetto di CysA su entrambi i controlli 2D e bioprinted 3D PTs è esplorato. In 2D, le cellule vengono seminate in un formato a 96 pozzetti su plastica di coltura tissutale e coltivate fino alla confluenza. Sono alimentati media secondo le linee guida di ATCC. CysA (Sigma-Aldrich, SML1018) è sospeso nei loro mezzi a varie concentrazioni e incubato con cellule per 24 h. Un saggio di vitalità utilizzando(3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carbossimetossifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolium) in presenza di metosolfato di fenazina (MTS) viene eseguito all’esposizione post 24 h mark. Questo test è completato su PTECs alla confluenza iniziale, somministrando CysA alle cellule il giorno in cui hanno raggiunto la confluenza, così come la confluenza tardiva, somministrando CysA diversi giorni dopo aver raggiunto la confluenza. In particolare, i risultati di tossicità sono simili per ogni caso (Fig. 5n). Per 3D PTs, CysA viene alimentato a varie concentrazioni attraverso il lume aperto dei tubuli maturi dopo aver raggiunto la confluenza (a ~3 marchio settimana), dove nessun siero è incluso nel supporto per un minimo di 10 giorni. Al segno di 24 ore dopo l’esposizione CysA, viene eseguito un test di tenuta FITC-dextran (descritto di seguito) per valutare e quantificare le perturbazioni alla funzione di barriera dei PTEC. Subito dopo, il PT viene fissato con formalina tamponata al 10% per 1 ora e controstinturato per actina e DAPI (la tabella S2 elenca le macchie specifiche utilizzate).

Misure di permeabilità diffusionale

Per valutare la funzione di barriera dell’epitelio in 3D, la permeabilità diffusionale viene quantificata perfusendo i media PTEC nel lume aperto contenenti 25 µg/mL di destrano coniugato con FITC 70 kDa (FITC-Dex, Sigma product 46945) ad una velocità di 15 µL/min per 3 min e 1 µL / min successivamente per ~30-45 min. L’intero test viene eseguito sotto imaging cellulare vivo con il tubulo e l’ECM circostante nel campo visivo (Fig. S9). Il modello di diffusione di FITC-Dex viene rilevato utilizzando un microscopio fluorescente ad ampio campo (Zeiss Axiovert 40 CFL). Le immagini di fluorescenza vengono catturate prima della perfusione e ogni 3-5 minuti per un periodo di 30-45 minuti. Diffusionale permeabilità di FITC-Dex è calcolato da quantificare variazioni di intensità di fluorescenza nel tempo utilizzando la seguente equation34;

Pd è la diffusione coefficiente di permeabilità, I1 è l’intensità media in un primo momento, I2 è un’intensità media a t ~ 30-45 min, Ib è l’intensità di sfondo (immagine presa prima di perfusione di FITC-Dex), e d è il diametro del canale. Altri ricercatori hanno riferito che PTECs possono riassorbire dextran39, che porterebbe a valori leggermente più alti per la permeabilità diffusionale misurata.

Abbiamo anche studiato le proprietà barriera dei nostri tubuli rivestiti epiteliali utilizzando un composto a basso peso molecolare, l’inulina (4,5 kDa) che non viene riassorbita né secreta in vivo da PTECs utilizzando lo stesso metodo sopra descritto. In particolare, l’inulina-FITC (Sigma product F3272) viene disciolta in mezzi PTEC riscaldati a 100 µg/mL e perfusa nel lume aperto ad una velocità di 20 µL/min per 3 min e 1,5 µL/min successivamente per ~15 min. L’intero test viene eseguito sotto imaging cellulare vivo con il tubulo e l’ECM circostante nel campo visivo (Fig. S7). Il modello di diffusione di FITC-inulina viene rilevato utilizzando un microscopio fluorescente a ampio campo (Leica). Le immagini a fluorescenza vengono catturate con una sorgente luminosa gated e uno stadio controllato dal movimento prima della perfusione e ogni 3-5 minuti nel periodo di 15 minuti per raccogliere misurazioni tecniche in triplice copia.

Microscopia elettronica

Per la microscopia elettronica a trasmissione (TEM), i PTEC in architetture 2D o 3D o il tessuto renale umano sano ottenuto da una biopsia standard prima del trapianto sono fissati utilizzando il 2,5% di glutaraldeide, l ‘ 1,25% di paraformaldeide e lo 0,03% di acido picrico in tampone di cacodilato di sodio 0,1 M (pH 7,4) per un minimo di diverse ore. Piccoli campioni (1 mm × 1 mm) vengono rimossi e lavati in tampone cacodilato da 0,1 M e immersi in 1% osmiumtetroxide (OsO4) (EMS) e 1.5% potassiumferrocyanide (KFeCN6) (Sigma) per 1 h, lavato in acqua 3x e incubato in 1% acquoso uranil acetato (EMS) per 1 h seguito da 2 lavaggi in acqua e successiva disidratazione in vari gradi di alcool (10 min ciascuno; 50%, 70%, 90%, 2 × 10 min 100%). I campioni vengono quindi messi in propilenossido (EMS) per 1 h e incubati durante la notte in una miscela 1:1 di propilenossido e TAAB Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, Canada). Il giorno seguente i campioni vengono incorporati in TAAB Epon e polimerizzati a 60 °C per 48 h. Le sezioni ultrasottili (circa 60 nm) vengono tagliate su un microtomo Reichert Ultracut-S, poste su griglie di rame colorate con citrato di piombo ed esaminate in un microscopio elettronico a trasmissione JEOL 1200EX e le immagini vengono registrate con una telecamera CCD AMT 2k. L’analisi delle immagini viene eseguita utilizzando il software ImageJ.

Per la microscopia elettronica a scansione (SEM), i PTEC perfusi in 3D sono fissati utilizzando formalina tamponata al 10% per 1 h. I campioni sono tagliati sottilmente (~1 mm di spessore) per esporre le cellule che circoscrivono il lume aperto. Il fissativo viene lavato via usando PBSx2 e successiva disidratazione in vari gradi di etanolo (20 min ciascuno; 30%, 50%, 70%, 90%, 3 × 20 min 100%). I campioni vengono quindi posti in etanolo al 50% e esametildisilazano al 50% (HMDS) per 30 min seguiti da HMDS al 100% 3 × 30 min. Tutti i passaggi vengono eseguiti in un contenitore di vetro chiuso e sigillato. Dopo il lavaggio finale con HMDS, i campioni vengono rimossi e posti in un contenitore aperto sotto N2 nella cappa aspirante per asciugare. I campioni essiccati sono montati su supporti in alluminio con nastro di carbonio conduttivo, sputter rivestito d’oro e imaged con un Tescan Vega SEM.

Immunostening

L’immunostening seguito da microscopia confocale è usato per valutare la localizzazione cellulare delle proteine nei modelli 2D e 3D di PTEC. Prima di immunotaining, ogni costrutto è lavato con PBS ed allora è riparato per 20 min a 1 h facendo uso di formalina tamponata 10%. Il fissativo viene rimosso utilizzando diversi lavaggi in PBS per diverse ore e poi bloccato durante la notte utilizzando 1 peso% di albumina sierica bovina (BSA) in PBS. Gli anticorpi primari alla proteina cellulare o al biomarcatore di interesse sono incubati con i costrutti per 1 giorno alle diluizioni elencate nella Tabella S2 in una soluzione di 0,5 wt% BSA e 0,125 wt% Triton X-100. La rimozione degli anticorpi primari non legati viene eseguita utilizzando una fase di lavaggio contro una soluzione di PBS o 0,5 wt% BSA e 0,125 wt% Triton X-100 in PBS per 1 giorno. Gli anticorpi secondari sono incubati con i costrutti per 1 giorno alle diluizioni elencate nella Tabella S2 in una soluzione di 0,5 wt% BSA e 0,125 wt% Triton X-100 in PBS. I campioni sono contro-macchiati con NucBlue o ActinGreen per 2 h e poi lavati per 1 giorno in PBS prima dell’imaging.

Rendering e analisi delle immagini

La microscopia a contratto di fase viene eseguita utilizzando un mirino Leica DM IL invertito con obiettivi da 1,25 X a 40X. La microscopia confocale viene eseguita utilizzando uno Zeiss LSM 710 verticale con obiettivi ad immersione in acqua da 5X a 40X impiegando laser spettrali a lunghezze d’onda di 405, 488, 514, 561 e 633 nm. Le ricostruzioni delle immagini di z-stack vengono eseguite in ImageJ utilizzando la funzione di proiezione z con l’impostazione dell’intensità massima dei pixel. Eventuali aumenti di luminosità vengono eseguiti in modo uniforme su un’intera immagine proiettata con Z. Le ricostruzioni di immagini 3D e i filmati rotanti (Movie S3) vengono eseguiti utilizzando il software Imaris. Il nuovo CytoSMART (Lonza) nel sistema dell’incubatrice è usato per catturare l’immagine di time-lapse (film S2). L’analisi delle immagini per la quantificazione della permeabilità diffusionale viene eseguita utilizzando script MATLAB personalizzati che utilizzano metodi precedentemente segnalati34. L’analisi delle immagini TEM viene eseguita utilizzando il software ImageJ per misurare l’altezza della cella (n ≥ 50), la densità dei microvilli (n ≥ 25) e la lunghezza dei microvilli (n ≥ 150) su almeno 3 campioni indipendenti per ogni condizione.

Analisi statistica

I dati sono espressi come media ± deviazione standard. L’analisi statistica viene eseguita utilizzando MATLAB e la significatività statistica viene determinata ad un valore di p < 0.05 come determinato da un ANOVA utilizzando il test di confronto multiplo a coppie di Tukey. Diversi livelli di significatività (valori p) sono indicati con asterischi e valori p specifici sono forniti in ogni legenda figura.