Gli aptameri sono emersi come una nuova categoria nel campo dei biorecettori grazie alle loro ampie applicazioni che vanno dal biosensing alla terapeutica. Sono state riportate diverse varianti del loro processo di screening, chiamato SELEX, che possono produrre sequenze con proprietà desiderate necessarie per il loro uso finale.

la Generazione di oligonucleotidi a singolo filamento libraryEdit

Il primo passo di SELEX prevede la sintesi di completamente o parzialmente randomizzati le sequenze oligonucleotidiche di lunghezza affiancato da aree definite che consentono l’amplificazione PCR di quelli randomizzati regioni e, in caso di RNA SELEX, la trascrizione in vitro di studi randomizzati sequenza. Mentre Ellington e Szostak hanno dimostrato che la sintesi chimica è in grado di generare ~1015 sequenze uniche per le librerie di oligonucleotidi nel loro articolo del 1990 sulla selezione in vitro, hanno scoperto che l’amplificazione di questi oligonucleotidi sintetizzati ha portato a una significativa perdita di diversità del pool a causa di pregiudizi e difetti della PCR nei frammenti sintetizzati. Il pool di oligonucleotidi viene amplificato e una quantità sufficiente della libreria iniziale viene aggiunta alla reazione in modo che ci siano numerose copie di ogni singola sequenza per ridurre al minimo la perdita di potenziali sequenze di legame a causa di eventi stocastici. Prima che la libreria venga introdotta in target per l’incubazione e la conservazione selettiva, la libreria di sequenze deve essere convertita in oligonucleotidi a singolo filamento per ottenere conformazioni strutturali con proprietà di legame target.

Target incubationEdit

Immediatamente prima dell’introduzione del target, la libreria oligonucleotidica a singolo filamento viene spesso riscaldata e raffreddata lentamente per rinaturalizzare gli oligonucleotidi in strutture secondarie e terziarie termodinamicamente stabili. Una volta preparata, la libreria randomizzata viene incubata con target immobilizzato per consentire il legame oligonucleotide-target. Ci sono diverse considerazioni per questa fase di incubazione target, tra cui il metodo di immobilizzazione target e le strategie per la successiva separazione degli oligonucleotidi non legati, il tempo e la temperatura di incubazione, le condizioni del buffer di incubazione e le concentrazioni di target rispetto agli oligonucleotidi. Esempi di metodi di immobilizzazione target includono colonne cromatografiche di affinità, filtri di analisi di legame alla nitrocellulosa e perline paramagnetiche. Recentemente, le reazioni di SELEX sono state sviluppate dove l’obiettivo è cellule intere, che vengono espanse vicino alla confluenza completa e incubate con la libreria oligonucleotide su piastre di coltura. Le condizioni del buffer di incubazione vengono alterate in base all’obiettivo previsto e alla funzione desiderata dell’aptamer selezionato. Ad esempio, nel caso di piccole molecole e proteine caricate negativamente, vengono utilizzati tamponi salini elevati per lo screening della carica per consentire ai nucleotidi di avvicinarsi al bersaglio e aumentare la possibilità di uno specifico evento di legame. In alternativa, se la funzione aptamer desiderata è in vivo proteina o cellula intera vincolante per potenziale applicazione terapeutica o diagnostica, condizioni tampone di incubazione simili a concentrazioni di sale plasmatico in vivo e temperature omeostatiche sono più propensi a generare aptamers che possono legarsi in vivo. Un’altra considerazione in condizioni di buffer di incubazione è concorrenti non specifici. Se esiste un’alta probabilità di ritenzione di oligonucleotidi non specifici nelle condizioni di reazione, i concorrenti non specifici, che sono piccole molecole o polimeri diversi dalla libreria SELEX che hanno proprietà fisiche simili agli oligonucleotidi della libreria, possono essere utilizzati per occupare questi siti di legame non specifici. Variando la concentrazione relativa di bersaglio e oligonucleotidi può anche influenzare le proprietà degli aptamers selezionati. Se una buona affinità di legame per l’aptamer selezionato non è un problema, allora un eccesso di target può essere utilizzato per aumentare la probabilità che almeno alcune sequenze si leghino durante l’incubazione e vengano mantenute. Tuttavia, ciò non fornisce alcuna pressione selettiva per un’elevata affinità di legame, che richiede che la libreria oligonucleotide sia in eccesso in modo che vi sia competizione tra sequenze uniche per siti di legame specifici disponibili.

Sequenza di legame eluizione e amplificazioneedit

Una volta che la libreria oligonucleotidica è stata incubata con target per un tempo sufficiente, gli oligonucleotidi non legati vengono lavati via dal target immobilizzato, spesso utilizzando il buffer di incubazione in modo che gli oligonucleotidi specificamente legati vengano mantenuti. Con sequenze non legate lavate via, le sequenze specificamente legate vengono poi eluite creando condizioni di denaturazione che promuovono lo svolgimento dell’oligonucleotide o la perdita di conformazione legante, incluso il flusso in acqua deionizzata, utilizzando soluzioni di denaturazione contenenti urea ed EDTA, o applicando calore elevato e forza fisica. Dopo l’eluizione delle sequenze legate, gli oligonucleotidi trattenuti vengono trascritti al DNA nel caso di RNA o selezioni di base modificate, o semplicemente raccolti per l’amplificazione nel caso di DNA SELEX. Questi modelli di DNA da sequenze elutate vengono quindi amplificati tramite PCR e convertiti in DNA a singolo filamento, RNA o oligonucleotidi di base modificati, che vengono utilizzati come input iniziale per il prossimo ciclo di selezione.

Ottenere ssDNAEdit

Uno dei passaggi più critici nella procedura SELEX è ottenere DNA single stranded (ssDNA) dopo la fase di amplificazione PCR. Questo servirà come input per il ciclo successivo, quindi è di vitale importanza che tutto il DNA sia single stranded e il meno possibile venga perso. A causa della relativa semplicità, uno dei metodi più utilizzati è l’utilizzo di primer invertiti biotinilati nella fase di amplificazione, dopo di che i fili complementari possono essere legati a una resina seguita da eluizione dell’altro filo con liscivia. Un altro metodo è la PCR asimmetrica, dove la fase di amplificazione viene eseguita con un eccesso di primer in avanti e pochissimo primer inverso, che porta alla produzione di più del filo desiderato. Uno svantaggio di questo metodo è che il prodotto deve essere purificato dal DNA a doppio filamento (dsDNA) e dall’altro materiale residuo della reazione PCR. La degradazione enzimatica del filo indesiderato può essere eseguita etichettando questo filo usando un primer fosfato, poiché è riconosciuto da enzimi come l’esonucleasi Lambda. Questi enzimi poi degradano selettivamente il filo etichettato fosfato lasciando intatto il filo complementare. Tutti questi metodi recuperano circa il 50-70% del DNA. Per un confronto dettagliato fare riferimento all’articolo di Svobodová et al. dove questi e altri metodi vengono confrontati sperimentalmente. Nella SELEX classica, il processo di generazione di librerie a singolo filamento randomizzato, incubazione target ed eluizione e amplificazione della sequenza di legame descritto sopra vengono ripetuti fino a quando la stragrande maggioranza del pool mantenuto è costituito da sequenze di legame target, anche se ci sono modifiche e aggiunte alla procedura che vengono spesso utilizzate, che sono discusse di seguito.

Selezione negativa o contromodifica

Al fine di aumentare la specificità degli aptamers selezionati da una determinata procedura SELEX, è possibile aggiungere una fase di selezione negativa o selezione contatore prima o immediatamente dopo l’incubazione dell’obiettivo. Per eliminare le sequenze con affinità per i componenti della matrice di immobilizzazione target dal pool, è possibile utilizzare la selezione negativa dove la libreria viene incubata con i componenti della matrice di immobilizzazione target e le sequenze non legate vengono mantenute. La selezione negativa può anche essere utilizzata per eliminare sequenze che legano molecole o cellule simili a target incubando la libreria oligonucleotide con analoghi target di piccole molecole, tipi di cellule indesiderate o proteine non bersaglio e mantenendo le sequenze non legate.

Tracking selection progressionEdit

Per tracciare il progresso di una reazione SELEX, il numero di molecole legate al bersaglio, che è equivalente al numero di oligonucleotidi eluiti, può essere confrontato con l’input totale stimato di oligonucleotidi dopo l’eluizione ad ogni round. Il numero di oligonucleotidi eluiti può essere stimato attraverso stime di concentrazione di eluizione tramite assorbanza di lunghezza d’onda di 260 nm o etichettatura fluorescente di oligonucleotidi. Man mano che la reazione SELEX si avvicina al completamento, la frazione della libreria oligonucleotidica che lega il bersaglio si avvicina al 100%, in modo tale che il numero di molecole elutate si avvicini alla stima di ingresso dell’oligonucleotide totale, ma possa convergere in un numero inferiore.

Avvertenze e considerazionimodifica

Alcune reazioni SELEX possono generare sonde che dipendono dalle regioni di legame del primer per la formazione di strutture secondarie. Esistono applicazioni aptamer per le quali è auspicabile una breve sequenza, e quindi il troncamento del primer. Un avanzamento sul metodo originale consente a una libreria di RNA di omettere le regioni di primer costanti, che possono essere difficili da rimuovere dopo il processo di selezione perché stabilizzano strutture secondarie instabili quando formate dalla sola regione casuale.