Le piante hanno la capacità di regolare la loro crescita e sviluppo in risposta a segnali di luce e temperatura (1). Il rilevamento della temperatura aiuta le piante a determinare quando germinare, regolare il loro piano corporeo per proteggersi dalle temperature avverse e fiorire. Le temperature calde e la luce ridotta derivante dall’ombra vegetativa favoriscono la crescita del gambo, consentendo alle piantine di evitare lo stress termico e l’ombra del baldacchino dalle piante vicine. Considerando che la percezione della luce è guidata da una collezione di fotorecettori identificati, tra cui i fitocromi assorbenti la luce rossa/rossa lontana; i criptocromi assorbenti la luce blu/ultravioletta-A (UV-A), le fototropine e i membri della famiglia Zeitlupe; e i sensori di temperatura UVR8 (2) assorbenti UV-B rimangono da stabilire (3). Trovare l’identità (o le identità) dei sensori di temperatura sarebbe di particolare importanza nel contesto dei cambiamenti climatici (4).

Il fitocromo B (phyB) è il principale fotorecettore che controlla la crescita nelle piantine di Arabidopsis esposte a diverse condizioni di ombra (5). Come altri nella famiglia del fitocromo, phyB è una cromoproteina omodimerica, con ogni subunità che ospita un cromoforo legato covalentemente della fitocromobilina. phyB esiste in due forme foto-interconvertibili: uno stato Pr che assorbe la luce rossa biologicamente inattivo e uno stato Pfr che assorbe la luce rossa lontano biologicamente attivo (6, 7). Mentre il Pr sorge dopo l’assemblaggio con il bilin, la formazione di Pfr richiede luce e i suoi livelli sono fortemente influenzati dal rapporto luce rosso/lontano-rosso. Di conseguenza, poiché la luce rossa viene assorbita dai pigmenti fotosintetici, la luce ombra della vegetazione vicina ha un forte impatto sui livelli di Pfr riducendo questo rapporto (8). phyB Pfr ritorna spontaneamente al Pr in una reazione indipendente dalla luce chiamata reversione termica (9-11). Tradizionalmente, la reversione termica è stata ritenuta troppo lenta rispetto alle reazioni della luce per influenzare lo stato Pfr di phyB, anche sotto irradianze moderate trovate in ambienti naturali, ma due osservazioni contraddicono questa visione. In primo luogo, la formazione di corpi nucleari phyB, che riflette lo stato di Pfr, è influenzata dalla luce fino a irradianze molto più alte del previsto se la reversione termica fosse lenta (12). In secondo luogo, ora è chiaro che la reversione termica avviene in due fasi. Anche se il primo passo, dal Pfr: Pfr omodimero (D2) al Pfr:Pr eterodimero (D1), è lento (kr2), il secondo passo, dal Pfr:Pr eterodimero al Pr:Pr omodimero (D0), è quasi due ordini di grandezza più veloce (kr1) (Fig. 1 BIS) (11).

Le temperature fisiologicamente rilevanti potrebbero modificare la grandezza di kr1 e di conseguenza influenzare i livelli di Pfr e D2, anche in condizioni di illuminazione (Fig. 1 BIS). Per testare questa ipotesi, abbiamo utilizzato la spettroscopia in vitro e in vivo e l’analisi di corpi nucleari FIB mediante microscopia confocale. Per il primo di questi approcci, abbiamo prodotto phyB ricombinante a lunghezza intera con il suo cromoforo di fitocromobilina. Quando irradiato sotto luce rossa continua, l’assorbanza in vitro a 725 nm ha raggiunto valori più bassi a temperature più elevate, il che è indicativo di ridotti livelli di Pfr allo steady-state (Fig. 1, lettere B e C). Abbiamo calcolato le differenze tra gli spettri di assorbanza allo stato stazionario nell’oscurità e la luce rossa continua (absorb assorbanza). L’ampiezza tra i picchi massimo e minimo di assorbanza∆, che rappresenta la quantità di Pfr, è fortemente diminuita tra 10 e 30°C (Fig. 1, D ed E). Questa caratteristica di phyB differisce dal comportamento tipico degli enzimi, che mostrano una maggiore attività nello stesso intervallo di temperatura (13).

Abbiamo anche misurato con spettroscopia in vivo i livelli stazionari di phyB Pfr in piantine irradiate con luce rossa o bianca continua a diverse temperature (applicata solo durante l’irradiazione). L’aumento delle temperature ha ridotto sia il pool totale di Pfr che quello di D2 (Fig. 1F e fig. S1), che è considerata la specie fisiologicamente rilevante per phyB (11). Utilizzando questi dati, abbiamo determinato kr1, che è aumentato con la temperatura (Fig. 1G).

La formazione del corpo nucleare phyB aumenta con l’irraggiamento e il rapporto luce rosso / lontano-rosso (12, 14) perché dipende da D2 (11). Come proxy per l’impatto della temperatura su D2, abbiamo usato la differenza nella formazione del corpo nucleare nelle linee del mutante phyB-9-null salvato con phyB non modificato o uno dei due mutanti tascabili cromofori che sopprimono la reversione termica Pfr in vitro con poco o nessun effetto sulla fotoconversione (phyBY361F-YFP e phyBR582A-YFP) (15, 16). Le piantine de-etiolate (verdi)sono state trasferite alle diverse condizioni di luce (irradianze e rapporti luce rosso/lontano-rosso) rappresentative della luce solare non filtrata, dell’ombra del baldacchino o delle giornate nuvolose, in combinazione con diverse temperature applicate solo durante i trattamenti di luce (fig. S2). La dimensione del corpo nucleare di phyBY361F-YFP e phyBR582A-YFP non è stata significativamente influenzata dall’irraggiamento (fig. S3) e fortemente influenzato dal rapporto rosso/lontano-rosso (fig. S4). Ciò è coerente con la nozione che le risposte di irraggiamento dipendono da kr1 e kr2 (11), che sono influenzati nei mutanti. La dimensione dei corpi nucleari phyB variava quadraticamente con la temperatura ed era più grande a ~20°C (Fig. 2A e fig. S5). Abbiamo testato l’ipotesi che la fase negativa di questa risposta alla temperatura sia la manifestazione di una maggiore reversione termica che riduce D2. A questo scopo, abbiamo modellato la dimensione media dei corpi nucleari phyBY361F-YFP e phyBR582A-YFP (tabelle S1 e S2) in funzione sia degli effetti D2 (11) che della temperatura non mediati dai cambiamenti in D2 (fig. S6). Quindi, abbiamo usato questo modello limitato per prevedere i livelli di D2 dalle dimensioni del corpo nucleare phyB in linee wild-type (Fig. 2 TER). La differenza tra il registro apparente D2 in wild-type e il registro D2 di phyBY361F e phyBR582A nella stessa condizione di luce è mostrato in Fig. 2C (differenza media per tutte le condizioni di luce). I risultati indicano che le alte temperature diminuiscono il D2 apparente per il phyB wild-type in una vasta gamma di condizioni di luce.

Utilizzando i tre approcci di cui sopra, abbiamo dimostrato che l’attività di phyB diminuisce con l’aumentare della temperatura (Fig. 1 e 2), suggerendo due possibili esiti biologici. Uno è che i cambiamenti a valle nella segnalazione phyB compensano l’effetto della temperatura. L’orologio circadiano fornisce un esempio di compensazione della temperatura (17). L’altro è che la percezione phyB di segnali di temperatura controlla l’uscita fisiologica. Una previsione di quest’ultima ipotesi è che l’attività di phyB (D2) dovrebbe influenzare allo stesso modo la crescita indipendentemente dal fatto che sia alterata dalla luce, dalla temperatura o dalle mutazioni che stabilizzano phyB. Per testare questa previsione, abbiamo coltivato piantine di Arabidopsis (comprese le varianti genetiche fitogenetiche) alla stessa irraggiamento e temperatura, selezionandole per i diversi ambienti di luce e temperatura (fig. S2), e la crescita modellata in queste condizioni (tabella S3) in funzione di D2.

Le risposte di crescita alla temperatura (fig. S7) e light (18) non sono mediati esclusivamente da phyB (D2). Quindi, abbiamo costruito il modello in due passaggi: innanzitutto, adattando sottomodelli univariati che descrivono la relazione tra la crescita e i singoli fattori (D2, effetti della temperatura non mediati dai cambiamenti in D2 e attività di altri recettori foto-sensoriali), e quindi combinando tali componenti nel modello finale. Quantificare il contributo di D2 (fig. S8), abbiamo usato la crescita a 30°C (nessuna inibizione a bassa temperatura della crescita) (fig. S9) di tutti i genotipi, comprese le varianti phyB stabilizzate e il mutante phyB-null (D2 = 0). Quantificare gli effetti della temperatura non mediati dalle variazioni di D2 (fig. S9B), abbiamo usato il mutante phyB (nessuna inibizione phyB-mediata) a 1 µmol m−2 s−1 (a questa irradiazione, ea 30°C, la crescita è massima, indicando che altri fotorecettori non danno un forte contributo). Per quantificare il contributo di altri fotorecettori (fig. S10), abbiamo usato il mutante phyB (nessuna inibizione phyB-mediata) ad una gamma di irradianze a 30°C (nessuna inibizione della crescita a bassa temperatura). L’unica interazione statisticamente significativa tra questi termini è stata tra D2 e gli effetti della temperatura non mediati dalle variazioni di D2 (tabella S4). Pertanto, nel modello finale, la crescita era inversamente correlata ai termini che rappresentavano le azioni di D2, le basse temperature (non mediate dai cambiamenti in D2), altri recettori foto-sensoriali e l’interazione sinergica tra D2 e bassa temperatura (non mediata dai cambiamenti in D2).

Abbiamo quindi adattato alla crescita del modello per tutte le 200 combinazioni luce-temperatura-genotipo. La relazione tra dati osservati e previsti non ha mostrato alcuna deviazione sistematica dalla correlazione 1:1 per la diversa luce (Fig. 3A), temperatura (Fig. 3B), o varianti genetiche con alterata stabilità Pfr (Fig. 3 QUATER). I dati previsti sono stati ottenuti con valori D2 influenzati da luce, temperatura e genotipo. Per testare il significato degli effetti della temperatura mediati dai cambiamenti nello stato di phyB, abbiamo ricalcolato la crescita usando D2 modificato dalla luce e dal genotipo ma non dalla temperatura (costante 10°C). Questa regolazione ha ridotto la bontà del modello di crescita della vestibilità (Fig. 3B, inserto), indicando che il contributo degli effetti della temperatura fib-mediati sulla crescita è statisticamente significativo e non deve essere trascurato. Perché abbiamo stimato l’effetto di D2 utilizzando i dati di una singola temperatura (fig. S8), il nostro modello di crescita non si basa sul presupposto che D2 cambi con la temperatura, fornendo così la certezza che quest’ultima conclusione sia genuina.

Abbiamo usato il modello di crescita per confrontare il contributo di ciascuno dei tre termini dipendenti dalla temperatura all’inibizione della crescita da parte delle basse temperature. Gli effetti fib-mediati della temperatura contribuiscono alla risposta globale della temperatura (Fig. 3D). Gli effetti sono stati grandi a basse irradianze, diminuiti con irradianze intermedie (le reazioni della luce diventano sempre più importanti) e aumentati di nuovo a irradianze più elevate perché ora D2 influisce più fortemente sulla crescita.

I fitocromi sono stati scoperti e sono stati studiati sulla base del loro ruolo di recettori della luce nelle piante (6, 7). Tuttavia, le nostre osservazioni che la temperatura altera la quantità di D2 per phyB (Figs. 1 e 2) e la sua uscita fisiologica in modo simile alla luce (Fig. 3) indicare che phyB dovrebbe anche essere definito come un recettore cue temperatura. phyB richiede luce per rispettare questa funzione di temperatura, avendo bisogno di luce per generare inizialmente lo stato Pfr instabile ma bioattivo. La temperatura influisce sullo stato Pfr di phyB principalmente tramite kr1 nella luce (Fig. 1) e via kr2 durante la notte (19). I recettori sono spesso attivati dai loro ligandi; sebbene phyB sia attivato dalla luce rossa, è inattivato dalla luce rossa e dalle alte temperature. Questa combinazione di percezione della luce e della temperatura servirebbe a integrare i segnali che controllano la foto e la termomorfogenesi in modi che ottimizzano la crescita delle piante esposte a una vasta gamma di ambienti.

Correction (17 November 2016): Report: “Phytochrome B integra segnali di luce e temperatura in Arabidopsis” di M. Legris et al. (18 novembre 2016, p. 897). Questo documento è stato originariamente pubblicato online come prima versione il 27 ottobre 2016. Questa informazione è stata ripristinata alla fine dell’articolo.