Soggetti dello studio, campioni clinici e genotipizzazione HLA. Tutti i soggetti con una storia di trasfusione di sangue sono stati esclusi dallo studio. Trentadue famiglie con una storia di sclerodermia simplex sono state reclutate e studiate per gli alleli HLA di classe II e classe I; 3 generazioni sono state studiate per 20 famiglie e 2 generazioni per 12 famiglie. Tre generazioni sono state richieste per l’ingresso allo studio per tutte le donne con bambini, e la partecipazione di tutti i bambini è stata richiesta perché il microchimerismo potrebbe derivare dalla madre o da un bambino in questi soggetti. La partecipazione di uomini, bambini e donne mai in gravidanza comprendeva 2 generazioni (cioè il soggetto e la madre). Un paziente di sclerodermia era un gemello; il gemello inalterato inoltre è stato reclutato allo studio. Sono state reclutate trentatré famiglie di controllo sane, tra cui 22 con 3 generazioni e 11 con 2 generazioni. La genotipizzazione HLA è stata completata per un totale di 254 individui: 128 nelle famiglie di sclerodermia e 126 nei controlli. Alcuni membri aggiuntivi della famiglia sono stati inclusi per confermare le assegnazioni di aplotipo HLA. Da questo database, i soggetti sono stati selezionati per ulteriori studi quando la madre del soggetto aveva un allele HLA non condiviso che è stato preso di mira da saggi specifici per HLA. Tutti i soggetti hanno concesso il consenso informato come approvato dal Fred Hutchinson Cancer Research Center Institutional Review Board.

I PBMC sono stati isolati da sangue eparinizzato intero mediante diluizione in HBSS, seguita da centrifugazione a gradiente Ficoll-Hypaque (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Svezia) a 1,077 g/mL. Per alcuni bambini, il DNA è stato estratto dalle radici dei capelli per la tipizzazione HLA come descritto in precedenza (9). Il DNA genomico è stato estratto dai PBMC utilizzando un kit di estrazione nucleica Isoquick (Orca Research Inc., Bothell, Washington, USA), secondo le istruzioni del produttore, e risospeso in 10 mM Tris-HCl (pH 9.0). La quantità e la purezza del DNA sono state determinate con metodi spettrofotometrici standard. Per alcuni soggetti, il DNA è stato estratto direttamente da campioni di sangue intero.

La tipizzazione basata sul DNA con pannelli di sonda oligonucleotide specifici per sequenza è stata utilizzata per identificare alleli specifici nei loci DRB1, DRB3, DRB4, DRB5, DQA1 e DQB1. Per DRB1, un test iniziale a bassa risoluzione rileva le famiglie DRB1 da DBR1*01 a DRB1*14 ed è seguito da 1 o più test ad alta risoluzione che identificano specifici alleli DRB1 come descritto in precedenza (10, 11). Gli alleli DQA1 e DQB1 sono stati determinati utilizzando metodi simili a quelli descritti in precedenza (9), con sonde aggiuntive aggiunte per rilevare gli alleli appena identificati (12). Gli antigeni di classe I HLA sono stati determinati utilizzando un test standard di linfocitotossicità che discrimina 20 HLA-A, 30 HLA-B e 8 antigeni HLA-Cw. Alcuni campioni sono stati sottoposti a sequenziamento per determinare specifici alleli di classe I HLA (13). Per confermare le assegnazioni di allele e antigeni HLA e l’omozigosi, sono stati genotipizzati più membri della famiglia, inclusi padri e fratelli di soggetti, quando disponibili.

Primer PCR specifici per HLA. Le sequenze di primer sono state progettate sulla base di tutte le sequenze di allele conosciute (12). La sintesi del primer è stata fatta da Oligos ecc. (Wilsonville, Oregon, Stati Uniti d’America). Un set di primer è stato progettato per indirizzare un polimorfismo HLA classe I e 3 polimorfismi HLA classe II mirati. Per colpire HLA-B44, è stato progettato un primer che amplifica un gruppo di alleli HLA-B basati su polimorfismi nelle posizioni 66, 69 e 75 dell’esone 3 e un altro gruppo di alleli HLA-B basati su un polimorfismo nella posizione 229 dell’esone 3. La combinazione di primer amplifica specificamente gli alleli HLA-B44, producendo un frammento di 190 bp. Tutti i primer specifici per DRB sono stati progettati per amplificare gruppi allelici basati su polimorfismi di sequenza nella regione ipervariabile dell’esone 2. Per HLA-DRB5 * 01, un primer amplifica un gruppo di alleli DRB5*01 basati su polimorfismi alle posizioni 25, 26, 31, 32 e 38 e l’altro amplifica un gruppo di alleli DRB5*01 basati su polimorfismi tra le posizioni 215 e 231. La combinazione di primer amplifica specificamente gli alleli HLA-DRB5 * 01, producendo un frammento di 210 bp. Per HLA-DRB1 * 04, un primer amplifica un gruppo di alleli DRB1*04 basati su polimorfismi alle posizioni 25, 26, 31 e 36 e l’altro amplifica un gruppo di alleli DRB1*04 basati su polimorfismi alle posizioni 97 e 110. La combinazione di primer amplifica specificamente DRB1 * 04, producendo un frammento di 104 bp. Ulteriore discriminazione tra gli alleli DRB1*04 è stata ottenuta utilizzando il primo primer insieme a 1 dei 2 primer che discriminano un dimorfismo alla posizione 258 (codone 86), producendo un frammento di 263 bp. Per HLA-DRB1 * 11, un primer amplifica un gruppo di alleli DRB1 * 11 basati su polimorfismi in posizioni 25, 26, 28, 30, 31, 32, e 35 dell’esone 2, e il secondo primer amplifica un gruppo di alleli DRB1*11 basati su polimorfismi alle posizioni 173 e 174 dell’esone 2. The combination of primers specifically amplifies DRB1*11 and produces a 178-bp fragment. Primer sequences are as follows: B44-specific primers 5′-TCC GCG GGT ATG ACC AGG A-3′ and 3′-TCC AGG TAT CTG CGG AGC G-5′; DRB5*01-specific primers 5′-TTC TTG CAG CAG GAT AAG TAT-3′ and 3′-GTA GTT GTC CAC CGC GGC G-5′; DRB1*04-specific primers 5′-CCA CGT TTC TTG GAG CAG GTT AAA-3′ and 3′-GCG CAC GTA CTC CTC TTG GTG-5′; DRB1*11-specific primers 5′-CA CGT TTC TTG GAG TAC TCT AC-3′ and 5′-CTG GCT GTT CCA GTA CTC CT-5′.

HLA-specific PCR for maternal microchimerism. Le reazioni di PCR sono state eseguite in un volume di 50 µL contenente 1.25–1.5 µg di DNA genomico, 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3), 50 mmol/L di KCl, 1,5 mmol MgCl2, 0,001% di peso/vol gelatina, 260 µmol/L di ogni deossinucleotidi, 0,5 U Perfetta Corrispondenza PCR Enhancer (Stratagene, La Jolla, California, USA), 2,5 U DNA polimerasi AmpliTaq Gold (Perkin-Elmer, Applied Biosystems, Foster City, California, USA), e 20 pmol di ciascun HLA-con primer specifici. L’acqua ultrapura è stata aggiunta per costituire il volume finale di 50 µL. L’amplificazione consisteva in 5 minuti a 96°C, 35 cicli a 95°C per 35 secondi e a 65°C per 35 secondi per HLA-B44 (58,5°C per DRB5*01; 72°C per DRB1*04; 64,5°C per DRB1*11), quindi 72°C per 1 minuto, con una fase finale di estensione a 72°C per 10 minuti. L’amplificazione, la sensibilità e la specificità ottimali sono state raggiunte titolando MgCl2 e le concentrazioni del primer, il numero di termocicli e la temperatura di ricottura. Tutte le amplificazioni sono state eseguite in un sistema GeneAmp 9600 thermocycler (Perkin-Elmer Applied Biosystems). La sensibilità del test è stata determinata mediante esperimenti di spiking in cui il DNA bersaglio è stato diluito in serie e aggiunto a una quantità fissa di DNA di fondo corrispondente agli alleli del soggetto. I test PCR specifici per HLA-B44– e DRB5*01 sono stati in grado di rilevare almeno 1 cellula bersaglio in un background di 500.000 cellule; i test PCR specifici per HLA-DRB1*04– e DRB1*11 sono stati in grado di rilevare almeno 1 cellula bersaglio in un background di 100.000 cellule. Ogni saggio di PCR includeva i seguenti controlli: a) un controllo positivo del DNA da una linea cellulare con l’allele HLA di interesse (0,2-0,5 µg); b) un controllo positivo dalla madre del soggetto (0,2–0,5 µg); c) controlli negativi del DNA da una linea cellulare con gli stessi alleli HLA del soggetto (1,25 µg e 0,35 µg); e d) un controllo negativo costituito da tutti i reagenti PCR senza DNA. I prodotti PCR sono stati elettroforesi a 100 V di tensione costante per 1 ora in gel prefabbricati TBE al 6% o all ‘ 8% utilizzando una mini-cella Novex Xcell II (Novex, San Diego, California, USA). Ogni gel includeva controlli PCR positivi e negativi e una scala da 100 bp (SLL-100; Gensura, Del Mar, California, USA). I gel sono stati macchiati con macchia d’argento (Silver Stain Plus Kit, Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, California, USA) ed essiccato con il DryEase Gel Drying System (Novex). Il DNA estratto dal sangue intero è stato testato in 4 campioni di quantità insufficiente per isolare le PBMC. Tutti i test sono stati eseguiti in duplice copia e la maggior parte dei campioni sono stati analizzati più di una volta.

PCR misure precauzionali. È stata usata estrema cautela per evitare e rilevare possibili contaminazioni da PCR. Aree separate sono state utilizzate per la separazione PBMC, l’estrazione del DNA genomico, la configurazione e l’amplificazione della PCR e l’analisi dei prodotti PCR, con test PCR prima e dopo condotti in laboratori separati. Puntali per pipette resistenti all’aerosol (Molecular Bio-Products Inc., San Diego, California, USA) sono stati utilizzati in tutti gli esperimenti, e più controlli negativi sono stati inclusi in tutte le amplificazioni PCR.

Sequenziamento di prodotti PCR specifici per HLA. Sette microlitri del prodotto iniziale di PCR specifico per HLA sono stati sottoposti a ulteriori 40 cicli di amplificazione utilizzando i parametri di termociclaggio originali. Trenta microlitri di questo prodotto PCR sono stati elettroforesi in un gel di agarosio ultrapuro all ‘ 1,75% (GIBCO BRL, Grand Island, New York, USA) e colorati con una soluzione di bromuro di etidio (0,5 µg/mL). La band è stata asportata, eluita e purificata utilizzando un kit di estrazione del gel QIAquick (QIAGEN Inc., Valencia, California, Stati Uniti d’America). Il prodotto PCR purificato è stato eluito in 30 µL di 10 mmol Tris-HCl (pH 9,0) e 100 ng è stato aggiunto a una miscela di reazione contenente 8,0 µL di premiscela del reagente di sequenziamento (Thermo Sequenase; Amersham Corp., Arlington Heights, Illinois, USA), 12.5 pmol 5′ o 3’ primer e 1 µL DMSO (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, Stati Uniti d’America). L’acqua ultrapura è stata aggiunta per ottenere un volume finale di 20 µL. Le miscele di reazione di sequenziamento sono state riscaldate a 96 ° C per 3 minuti in un termociclatore GeneAmp System 9600, seguite da 25 cicli a 96°C per 10 secondi, 50°C per 5 secondi e 60°C per 4 minuti. I prodotti di PCR risultanti sono stati purificati in colonna ed elettroforesi come sopra. Le sequenze di senso e antisenso sono state determinate in duplicato per i prodotti PCR specifici per HLA del soggetto e della madre, nonché per i prodotti PCR della linea cellulare di controllo positivo. L’analisi della sequenza è stata eseguita utilizzando il software Wisconsin Package versione 9.1 di Genetics Computer Group (Madison, Wisconsin, USA).

Preparazione del vetrino Cytospin e ibridazione in situ. I preparati Cytospin slide sono stati analizzati per la presenza di sequenze specifiche del cromosoma X e Y, utilizzando una tecnica sviluppata nel laboratorio di citogenetica molecolare del Fred Hutchinson Cancer Research Center per l’analisi quantitativa del chimerismo in coppie di trapianti di cellule staminali non corrispondenti al sesso (14). Campioni di citospin di cellule maschili sono stati preparati mediante centrifugazione di 30.000-60.000 PBMC appena separati su vetrini, 300 µL per vetrino. I vetrini sono stati conservati in una camera di essiccazione fino all’uso. La sonda specifica per il cromosoma X DXZ1 (15) è stata tradotta nick con digoxigenina e la sonda specifica per il cromosoma Y DYZ1 (16) è stata tradotta nick con biotina. La miscela della sonda XY aveva una concentrazione finale di 0,5 µg / mL di ciascuna sonda in tampone di ibridazione del 50% di formammide, 2× SSC (0,3 M cloruro di sodio e 0,03 M citrato di sodio) e 10% di destrano solfato. È stato denaturato a 72°C per 5 minuti, raffreddato su ghiaccio e applicato al vetrino. I vetrini sono stati digeriti in pepsina (0,1 mg / mL in 0.01 M HCl) a 37 ° C per 3 minuti, fissato in formalina tamponata al 4% per 15 minuti, risciacquato in PBS, disidratato in etanolo (70%, 95% e 100%) e asciugato all’aria. I vetrini sono stati denaturati mediante trattamento in 2× SSC (72°C) per 10 minuti, 70% di formammide, 2× SSC (72°C) per 3 minuti, disidratati in una serie di etanolo (-20°C) e asciugati all’aria. Dieci microlitri di sonda sono stati applicati al vetrino e poi montati sotto un coprioggetto (22 × 22 mm) sigillato con cemento di gomma. È stato incubato durante la notte a 42°C in una camera umidificata. I vetrini sono stati lavati in formammide al 55%, 2× SSC (45°C) per 15 minuti e 2× SSC (temperatura ambiente) per 5 minuti. I segnali della sonda sono stati rilevati simultaneamente con anti-digossigenina accoppiata alla fluoresceina (diluizione 1:500; Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana, USA) e avidina accoppiata al rosso del Texas (diluizione 1: 500; Vector Laboratories, Burlingame, California, USA) per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. Dopo il lavaggio con 2× SSC e PBS, sono stati montati con VECTASHIELD (Vector Laboratories). Le diapositive sono state valutate direttamente utilizzando un microscopio a epifluorescenza Nikon E600 con una lampada al mercurio da 100 W dotata di opportuni filtri passa-banda singoli, doppi e tripli. Sono state enumerate solo le cellule con 2 segnali cromosomici visibili, senza utilizzare alcun miglioramento elettronico.