Risultati

Abbiamo studiato topi wild-type (WT), eterozigoti V2RV31R/WT e omozigoti V2R31R/V2R31R. I topi mutanti avevano numeri e frequenze normali di cellule spleniche αβ T mature e timociti in ogni fase dello sviluppo. A causa della mancanza di marcatori congenici, le proteine TCRß non possono essere identificate dall’allele che le codifica, né se includono regioni Cß1 rispetto a Cß2. Pertanto, abbiamo eseguito la citometria a flusso utilizzando anticorpi anti-V2 e anti-V31 per quantificare le cellule che esprimono le proteine V2+ e V31+ TCRß. Abbiamo analizzato CD4+ e CD8 + timociti single-positivi (SP) in quanto sono cellule αβ T mature e ingenue. Riflettendo i dati pubblicati (8, 9), abbiamo rilevato una piccola frazione (0,11%) di cellule che si sono macchiate di entrambi gli anticorpi nei topi WT (Fig. 1 B e C), che è coerente con una piccola popolazione di cellule V2+ V31 + αβ T. Abbiamo osservato una frazione aumentata di 12,4 volte di queste cellule nei topi V2R31R / WT e un aumento di 32,8 volte nei topi V2R31R/V2R31R (Fig. 1 B e C). Queste frequenze elevate delle celle dual-TCRß + corrispondevano ai maggiori utilizzi di V2 e V31 nelle catene TCRß espresse (Fig. 1 D-F). Questi dati dimostrano che migliorare la qualità RSS di due Vß sullo stesso allele aumenta il loro riarrangiamento e di conseguenza la frazione di cellule T che esprimono due tipi distinti di proteine TCRß. Poiché il repertorio Vß dei timociti SP riflette i livelli relativi che i singoli segmenti Vß ricombinano (10), l’uso preferenziale di V31 rispetto a V2 rivela che V31R supera V2R per il riarrangiamento. Ciò potrebbe essere dovuto alla maggiore accessibilità di V31 (11) o all’interazione di V31 con i segmenti Dß–Jß prima che la contrazione del locus TCRß collochi V2 vicino ai segmenti Dß–Jß. In particolare, l’aumento superiore al doppio di queste cellule dual-TCRß + nei topi V2R31R / V2R31R rispetto ai topi V2R31R / WT implica che due distinti riarrangiamenti V (D)Jß possono contribuire all’espressione di TCRß dallo stesso allele.

Per determinare se un singolo allele TCRß può effettivamente supportare l’espressione delle proteine TCRß da due diversi riarrangiamenti V(D)Jß, abbiamo analizzato topi in cui un allele TCRß è inattivato per delezione del potenziatore TCRß (Eß) (12, 13). Abbiamo analizzato i topi che trasportano l’allele Eß-cancellato di fronte a un allele WT, un allele con una sostituzione RSS di V2 (V2R) o V31 (V31R), o entrambi (8). Abbiamo rilevato una piccola percentuale (0,094%) di timociti V2+V31+ SP nei topi WT/EβΔ (Fig. 2 A e B), potenzialmente rappresentando una rara popolazione di cellule che esprimono due diverse proteine TCRß dallo stesso allele WT. Indipendentemente da ciò, abbiamo osservato le cellule V2+V31+ a una frequenza maggiore di 1,9 volte nei topi V2R/EβΔ e a una frequenza maggiore di 4,8 volte nei topi V31R/EβΔ (Fig. 2 Lettere A e B). Pertanto, migliorando la qualità di Vß RSS si eleva la frazione di cellule che esprimono sia le proteine V2+ che V31+ TCRß. In particolare, abbiamo rilevato una frequenza aumentata di 14,4 volte delle cellule V2 + V31 + nei topi V2RV31R/EβΔ rispetto ai topi WT/EβΔ (Fig. 2 A e B), indicando che migliorare la qualità di due Vß RSSs aumenta sinergicamente la percentuale di cellule che esprimono sia le proteine V2+ che V31+ TCRß. Infatti, eliminando parte del V31 RSS sull’allele V2R (l’allele V2R31Δ; Fig. 2C) riduce drasticamente la frequenza delle cellule V2+V31+ a livelli equivalenti o inferiori a quelli dei topi V2R/EβΔ (0,178% contro 0,135%; Fig. 2 Lettere A e B). Collettivamente, questi dati confermano che l’allele V2R31R promuove l’espressione di due distinte proteine TCRß da due diversi riarrangiamenti V (D)Jß su un singolo allele.

Il nostro studio dimostra che un meccanismo genetico intrinseco governa l’assemblaggio e l’espressione monogenica di TCRß. Dimostriamo che Vß RSSs di scarsa qualità cooperano per limitare l’assemblaggio e l’espressione di due geni TCRß distinti da un allele. In precedenza abbiamo dimostrato che Vß RSSs di scarsa qualità trattiene stocasticamente la frequenza di ricombinazione Vß prima dell’inibizione del feedback per ridurre l’assemblaggio biallelico e l’espressione dei geni TCRß (8). Ora concludiamo ulteriormente che Vß RSSs di bassa qualità riduce anche l’incidenza che sia V31 che un Vß a monte si ricombinano sullo stesso allele. Questi riarrangiamenti potrebbero comportare 1) un riarrangiamento V2 deletional al cluster Dß1–Jß1–Cß1 e un riarrangiamento V31 inversionale al cluster Dß2–Jß2–Cß2, o 2) un riarrangiamento V31 inversionale al cluster Dß1–Jß1–Cß1, che inverte una porzione del locus che contiene il cluster Dß2–Jß2–Cß2, e quindi un riarrangiamento V2 Cluster Dß2–Jß2–Cß2 (7) (Fig. 2D). Per ottenere l’assemblaggio e l’espressione monogenica di TCRß, questo meccanismo genetico basato su RSS potrebbe funzionare con processi epigenetici che sono stati implicati per imporre la ricombinazione monoallelica di Vß. Ad esempio, è stato proposto che le interazioni dinamiche dei segmenti Vß con la lamina nucleare riducano l’efficienza di ricombinazione Vß reprimendo l’accessibilità della cromatina Vß e il ciclo cromosomico tra cluster Dß–Jß e segmenti Vß a monte (14, 15). In questo contesto, Vß RSSs di scarsa qualità potrebbe ridurre la probabilità che due riarrangiamenti Vß si verifichino su un allele quando V31 e un segmento Vß upstream sono entrambi accessibili e il Vß upstream è in loop in prossimità dei segmenti Dß–Jß. Pertanto, le proprietà di RSSs possono essere alla base dell’assemblaggio monogenico e dell’espressione delle proteine TCRy, TCRδ e Igλ dei mammiferi nei mammiferi e delle proteine Ig nei pesci cartilaginei. Inoltre, V RSSs può contribuire allo stesso modo a Igk e Igλ esclusione isotopica nelle cellule B.