2.1 Respirazione anaerobica

Durante la respirazione, diverse deidrogenasi associate alla membrana ossidano i substrati idrosolubili e riducono il menaquinone (MK) nella membrana a menaquinolo. In condizioni aerobiche, gli elettroni vengono utilizzati per ridurre l’ossigeno all’acqua, mentre durante le condizioni anaerobiche, gli elettroni di crescita respiratoria del nitrato vengono trasferiti al nitrato per produrre nitrito (Fig. 5.1). Uno dei principali donatori di elettroni della respirazione è NADH + H + prodotto nella glicolisi e nel ciclo dell’acido tricarbossilico. Due tipi di NADH deidrogenasi legate alla membrana, NDH-I e NDH-II, sono stati descritti per i batteri per catalizzare l’ossidazione di NADH+H+ a NAD+ (Yagi, 1993). NDH-I consiste di 14 subunità, codificate dall’operone nuo in Escherichia coli, e contiene flavin mononucleotide (FMN) e diversi cluster ferro–zolfo per accoppiare il trasferimento di elettroni al pompaggio di protoni attraverso la membrana. NDH-II è costituito da una singola subunità codificata dal gene ndh. NDH-II non è una proteina di membrana integrale ma associata al lato interno della membrana citoplasmatica. Contiene flavina adenina dinucleotide (FAD) come gruppo protesico e il trasferimento di elettroni non è accoppiato alla traslocazione di protoni. Nel genoma di B. subtilis, tre geni, yjlD, yumB e yutJ, codificano le potenziali NADH deidrogenasi del tipo NDH-II, mentre un operone nuo è assente dal genoma di B. subtilis (Kunst et al., 1997). YjlD, rinominato Ndh, è costituito da 392 residui di aminoacidi e mostra il 29% di identità di sequenza a NDH-II di E. coli (Bergsma, Van Dongen, & Konings, 1982). È interessante notare che la quantità di proteina Ndh di B. subtilis è stato trovato significativamente ridotto in condizioni anaerobiche (Marino, Hoffmann, Schmid, Mobitz, & Jahn, 2000). Ndh sembra essere la principale NADH deidrogenasi aerobica di B. subtilis, poiché la mutazione del gene ndh ha mostrato un difetto di crescita aerobica (Gyan, Shiohira, Sato, Takeuchi, & Sato, 2006). Nel frattempo, è stato dimostrato che l’espressione dell’operone yjlC-ndh è regolata dal regolatore Rex, un regolatore trascrizionale a rilevamento redox, che risponde al rapporto NADH/NAD+ (vedere anche Sezione 3.3) (Gyan et al., 2006). Al contrario, l’espressione del gene yumB è stata trovata indotta in condizioni respiratorie di nitrati in studi sul trascrittoma (E. Härtig, risultati inediti). È necessario determinare se YumB e YutJ hanno attività NADH deidrogenasi come suggerito dalla somiglianza della sequenza proteica e se sono rilevanti in condizioni di crescita respiratoria dei nitrati.

Come altri organismi aerobi respiranti, B. subtilis possiede una succinato deidrogenasi (sdh) o più precisamente un succinato:chinone ossidoreduttasi, SQR (Hägerhäll, 1997). Il complesso enzimatico è parte integrante della membrana citoplasmatica nei batteri e della membrana mitocondriale interna negli eucarioti. Catalizza l’ossidazione del succinato a fumarato accoppiato alla riduzione del chinone. Pertanto, l’enzima è una parte funzionale sia del ciclo dell’acido citrico che della catena respiratoria (Hägerhäll, Aasa, von Wachenfeldt, Hederstedt, 1992). SQR in B. subtilis riduce MK e ha tre subunità proteiche, SdhA, SdhB e SdhC. SdhA è una flavoproteina con una MODA legata covalentemente che effettua l’ossidazione a due elettroni di succinato a fumarato nel citoplasma. SdhB contiene tre cluster ferro–zolfo (, , e) che funzionano nel trasferimento di elettroni tra il gruppo flavinico e l’eme b del citocromo b558 nell’SdhC. SdhC ha cinque segmenti α-elicoidali transmembrana e ancora il dimero SdhAB sul lato citoplasmatico della membrana e funziona nel trasferimento di elettroni transmembrana a MK (Hederstedt, Maguire, Waring, & Ohnishi, 1985; Matsson, Tolstoy, Aasa, & Hederstedt, 2000). I due cofattori eme b mediano il trasferimento di elettroni attraverso la membrana citoplasmatica al lato esterno della membrana in cui MK è ridotto e due protoni sono consumati (Hederstedt, 2002). Questo è diverso da E. coli dove i protoni per la riduzione di ubiquinone a ubiquinolo sono consumati sul lato negativo della membrana, che non influenza il potenziale di membrana. B. subtilis e altri bacilli, come i ceppi di Bacillus megaterium e Bacillus cereus, possono crescere in condizioni ossiche con succinato come fonte di carbonio ed energia (Schirawski & Unden, 1995, 1998).

B. subtilis, B. megaterium e B. cereus non crescono in condizioni anaerobiche in presenza di glicerolo. In accordo, i geni per una glicerolo-3-deidrogenasi mancano nei genomi. Tuttavia, un gene glpD per la variante aerobica del sistema di trasferimento elettronico localizzato a membrana è stato rilevato in B. subtilis. Nessuna omologia è stata trovata a geni che codificano altre deidrogenasi primarie presenti in E. coli come varie formiato deidrogenasi, idrogenasi, l-lattato deidrogenasi, d-amminoacido deidrogenasi, malato:chinone ossidoreduttasi, o la chinoproteina glucosio deidrogenasi. Ovviamente, B. subtilis possiede solo un insieme limitato di deidrogenasi primarie che donano elettroni, vale a dire varie forme di NDH-II e glicerolo-3-fosfato aerobico deidrogenasi.

In condizioni aerobiche, gli elettroni vengono passati dal menaquinolo attraverso il complesso del citocromo bc1 alla citocromo c ossidasi di tipo aa3. In condizioni microaerofile, viene utilizzata la menaquinol ossidasi di tipo citocromo bd con elevata affinità di ossigeno. Il fumarato come accettore terminale di elettroni è stato escluso per vari bacilli, incluso B. subtilis (Schirawski & Unden, 1995). Di conseguenza, i geni per una fumarato reduttasi non si trovano nel genoma di B. subtilis. Altri ceppi di bacilli, come Bacillus licheniformis e Bacillus circulans, possono respirare fumarato come E. coli.

In condizioni di crescita anaerobica, B. subtilis trasferisce gli elettroni esclusivamente alla nitrato reduttasi respiratoria. Nei batteri, tre diversi sistemi di nitrato reduttasi sono classificati: il NAD assimilabile citoplasmatico (P)H-dipendente nitrato reduttasi (Nas), la membrana-bound respiratorio nitrato reduttasi (Nar), e il periplasmico dissimilatoria nitrato reduttasi (Nap). Tutti e tre appartengono alla famiglia di proteine DMSO reduttasi e contengono il cofattore bis-molibdopterina guanina dinucleotide (MGD) (Moreno-Vivian, Cabello, Martinez-Luque, Blasco, & Castillo, 1999). Il genoma di B. subtilis codifica solo la nitrato reduttasi respiratoria Nar. Gli enzimi Nar in genere sono composti da tre subunità. La grande subunità NarG contiene il sito attivo con il cofattore MGD, una subunità solubile più piccola NARH ospita uno e tre centri, e subunità NarI è un citocromo b. Nar è una chinol ossidasi e la piscina menaquinolo è ossidato dal citocromo b subunità NarI. Due elettroni fluiscono attraverso l’eme b di NarI ai cluster ferro-zolfo di NarH e infine alla subunità citoplasmatica NarG che riduce il nitrato a nitrito. La proteina NarJ non fa parte dell’enzima ma è necessaria per l’assemblaggio finale dell’enzima legato alla membrana (Blasco, Iobbi, Ratouchniak, Bonnefoy, & Chippaux, 1990; Zakian et al., 2010). A causa dei diversi siti per l’ossidazione del chinolo nel periplasma e per la riduzione dei nitrati nel citosol, la nitrato reduttasi Nar contribuisce alla generazione di un gradiente protonico(Fig. 5.1). Il locus nar è costituito dall’operone narGHJI (codifica della nitrato reduttasi respiratoria), narK (per una potenziale proteina di estrusione di nitriti), il frame di lettura aperto ywiC (di funzione sconosciuta), arfM che codifica il modulatore della respirazione anaerobica e della fermentazione e anche il gene per il regolatore anaerobico Fnr (Cruz-Ramos et al., 1995; Kunst et al., 1997).

Il nitrito viene poi ulteriormente convertito in ammoniaca dalla nitrito reduttasi assimilabile NasDE (Cruz-Ramos et al., 1995; Hoffmann, Frankenberg, Marino,& Jahn, 1998; Hoffmann et al., 1995; Nakano & Zuber, 1998). La nitrito reduttasi assimilabile o ammonio-producente NADH-dipendente è un enzima contenente siroeme che catalizza la riduzione a sei elettroni del nitrito in ammonio. I geni della nitrito reduttasi nasDE facevano parte di un operone nasDEF e si trovavano immediatamente a valle dell’operone nasBC, che codifica la nitrato reduttasi dipendente dal NADH (Nakano, Yang, Hardin, & Zuber, 1995; Ogawa et al., 1995).