Come controllo negativo, l’anticorpo primario è stato sostituito con un anticorpo irrilevante, isotipo-abbinato per controllare il legame non specifico dell’anticorpo secondario. I controlli tissutali positivi che utilizzavano gli stessi protocolli IHC includevano la ghiandola mammaria normale canina (anticorpi anti-CK19, -ER, -CK14, -VIM, Alfa-SMA, -p63) e la pelle canina (anti-CK5/6).

Il numero di cellule positive per ciascun marcatore è stato calcolato semiquantitativamente: − = nessuna cellula macchiata, ± = meno del 5% di cellule positive, + = 5-50% di cellule positive, ++ = più del 50% di cellule positive. I casi sono stati considerati positivi per ER quando la colorazione nucleare è stata osservata in almeno 5% cellule tumorali .

3. Risultati

Quattro tipi di cellule mioepiteliali sono stati riconosciuti sulla base della loro morfologia. Il sottotipo a riposo mostrava le caratteristiche allungate delle cellule fusiformi a stretto contatto con le cellule epiteliali luminali e le cellule suprabasali proliferanti che invece mostravano una forma poligonale(Figura 1 (a)). Le cellule mobili interstiziali sono state osservate sia formando nidi (i nidi rivestiti di tipo fuso e le cellule stellate costituivano il nucleo del nido) che isolate nell’interstizio (Figura 2(a)).

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Figura 1

Soprabasale cellule mioepiteliali: riposo (sottili frecce) e proliferativa (spessore frecce) cellule. Espressione immunoistochimica di un gruppo di anticorpi applicati da IHC, 63x (a) Ematossilina-eosina; (b) anticorpi anti-CK19 che etichettano il citoplasma; (c) anticorpi anti-ER che etichettano i nuclei; (d) anticorpi anti-CK 5/6 che etichettano il citoplasma; (e) anticorpi anti-CK14 che etichettano il citoplasma; (f) anticorpi anti-VIM che etichettano il citoplasma; (g) anticorpi anti-Alfa-SMA che etichettano la membrana citoplasmatica; (h) anticorpi anti-p63 che etichettano i nuclei.

(a)

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(a)
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Figure 2

Motile myoepithelial cells: spindle (asterisks) and stellate (stars) cells. Immunohistochemical expression of a panel of antibodies applied by IHC. 63x (a) Hematoxylin-eosin; (b) anti-CK19 antibodies labeling the cytoplasm; (c) anti-ER antibodies labeling the nuclei; (d) anti-CK 5/6 antibodies labeling the cytoplasm; (e) anti-CK14 antibodies labeling the cytoplasm; (f) anticorpi anti-VIM che etichettano il citoplasma; (g) anticorpi anti-Alfa-SMA che etichettano la membrana citoplasmatica; (h) anticorpi anti-p63 che etichettano i nuclei.

3.1. Ghiandola mammaria normale

Nei 3 casi di controllo, tutte le cellule mioepiteliali soprabasali a riposo e proliferative sono state etichettate con p63, CK14, Alpha-SMA e VIM. Le cellule mioepiteliali soprabasali a riposo e proliferative non hanno espresso CK19 in nessuno dei casi.

3.2. Tessuto mammario dalla stessa linea del tumore mammario

Nei 29 tessuti normali nella stessa linea dei tumori, tutte le cellule mioepiteliali soprabasali a riposo e proliferative sono state etichettate con p63, CK14, Alfa-SMA e VIM. CK5 / 6 è risultato positivo in tutti i casi tranne quattro e ER è stato rilevato in 12 casi. L’espressione di CK19 è stata osservata solo nell’epitelio luminale. Non sono state osservate cellule interstiziali mobili mioepiteliali. Tutti i risultati sono riassunti nella Tabella 2.

3.3. Tumori mammari

I risultati immunoistochimici per cellule suprabasali (Figura 1) e mobili (Figura 2) utilizzando p63, CK14, CK5/6, CK19, Alpha-SMA, VIM e ER sono riassunti nella Tabella 2. CK5 / 6 marcato: cellule a riposo soprabasali in 16 dei 29 casi (5 carcinomi in tumori benigni misti e 11 carcinomi complessi). CK 5/6 ha anche etichettato le cellule proliferative suprabasali e mobili del fuso in 10 casi (3 carcinomi in tumori misti benigni e 7 carcinomi complessi). Le cellule mobili stellate erano presenti in 25 casi (1 tumore mioepiteliale benigno, 3 tumori mioepiteliali maligni, 5 carcinomi in tumori misti benigni e 15 carcinomi complessi) ma erano negativi per CK5/6. La cartilagine nei tumori misti mammari era sempre negativa.

CK14 ha mostrato positività in 23 casi in cellule a riposo (con l’eccezione di 1 complesso di carcinoma e benigne e maligne mioepiteliali tumori), in 22 casi in cellule proliferative (6 carcinomi in misto benigno tumori e 15 complesso carcinomi) con una tendenza a perdere l’espressione quando queste cellule ha acquistato il più motili fenotipo di cellule fusate (positivo in 2 benigna e 3 maligno mioepiteliali tumori, 2 carcinomi in misto benigno tumori e 2 complesso carcinomi). I condrociti di tumori misti erano negativi.

VIM è risultato positivo nelle cellule soprabasali nei 23 casi di carcinoma in tumore benigno e carcinoma complesso e nelle cellule mioepiteliali mobili in tutti i 29 casi. Le cellule stromali sono risultate positive in tutti i casi. La cartilagine è risultata VIM positiva in tutti e 7 i carcinomi nei tumori benigni misti.

Cellule mioepiteliali soprabasali a riposo e proliferative marcate con alfa-SMA in 23 carcinomi in tumori benigni-misti e carcinomi complessi. Le cellule del fuso in 10 casi (5 carcinomi in tumore misto benigno e 5 carcinomi complessi) hanno mostrato positività per Alfa-SMA. In ogni caso, ad eccezione di due carcinomi complessi, le cellule stellate erano negative. Lo stroma ha mostrato positività in soli 6 casi (1 carcinoma in tumore benigno-misto e 5 carcinomi complessi).

P63 è stato rilevato in cellule mioepiteliali soprabasali a riposo e proliferative dei 23 casi di carcinoma in tumore benigno-misto e carcinoma complesso. Tutte le cellule mobili del fuso e stellate erano negative. Le cellule stromali e la cartilagine erano negative.

L’espressione ER era presente in 11 cellule mioepiteliali soprabasali (4 carcinomi in tumori benigni misti e 7 carcinomi complessi); le cellule mobili del fuso e stellate sono risultate positive in 9 casi (3 carcinomi in tumori benigni-misti e 6 carcinomi complessi). La cartilagine dei tumori misti era negativa.

Le cellule mioepiteliali mobili a riposo e proliferative soprabasali e fusiformi / stellate non hanno espresso CK19 in nessuno dei tumori esaminati. Anche la cartilagine di tumori misti era negativa per CK19.

4. Discussione

Sulla base dei risultati di Gama et al. e Tateyama et al. , quattro tipi morfologici di cellule mioepiteliali sono presenti nella ghiandola mammaria: cellule mioepiteliali soprabasali a riposo e proliferative che rivestono alveoli e condotti e cellule mobili interstiziali fusiformi e stellate, che si trovano nello spazio interstiziale dove possono essere disposte in nidi. I marcatori mioepiteliali, come p63, CK5/6, CK14, Alpha-SMA e VIM, si sono rivelati preziosi coadiuvanti diagnostici per facilitare la valutazione di proliferazioni complesse e miste. CK19 è considerato il marcatore gold standard per l’epitelio luminale ed è stato utilizzato per evitare qualsiasi diagnosi errata con cellule mioepiteliali. A causa dei modelli di cross-reattività e del fatto che i fuochi lesionali sono tipicamente minuti, nessuno dei marcatori mioepiteliali ha goduto della sensibilità e della specificità del 100% per le cellule mioepiteliali. Come tale, almeno 2 marcatori dovrebbero essere utilizzati per valutare un dato focus .

Sulla base dei nostri risultati, il miglior marcatore per le cellule soprabasali è stato p63 soprattutto in associazione con CK14, che era limitato alle cellule mioepiteliali mature (basali) e, in misura minore, seguite da CK5 / 6, Alpha-SMA e VIM (Figura 1). Tuttavia, CK5 / 6 ha anche contrassegnato le cellule epiteliali luminali rendendo difficile distinguerle dalle cellule mioepiteliali suprabasali proliferative . Morfologicamente, sia le cellule epiteliali che quelle mioepiteliali possono avere una forma poligonale. Una caratteristica di CK14 e CK5/6, ma non di p63, Alfa-SMA e VIM, era la loro ridotta espressione nelle cellule mioepiteliali nello stato proliferativo soprabasale. L’espressione CK14, CK5/6 e p63 è stata gradualmente persa nelle cellule nello stato motile fuso e stellato.

Alfa-SMA e VIM erano presenti nelle cellule mioepiteliali mobili del mandrino con diversi gradi di intensità. Solo VIM ha dimostrato di essere un marker coerente per le cellule mioepiteliali mobili stellate. In questo studio, il mioepitelio stellato motile era disposto in nidi e rivestito da cellule a riposo presumibilmente di origine alveolare. Questa caratteristica può supportare l’idea che i nidi di cellule mioepiteliali mobili stellate, che hanno perso l’espressione dei principali marcatori soprabasali mioepiteliali, ma hanno mantenuto l’affinità per VIM, siano i precursori della cartilagine, indicando che queste cellule hanno completato la loro trasformazione in elementi mesenchimali. Nei tumori mioepiteliali benigni e maligni, l’etichettatura VIM in tutti i casi, la perdita di tutti gli altri marcatori mioepiteliali soprabasali e la scarsa positività a CK14 nelle cellule del fuso erano indicativi di un’espressione prevalente dello stato motile del mioepitelio e di un possibile passaggio da cellule mioepiteliali semplici a fibroblasti mesenchimali.

Nel nostro studio, la prova delle cellule mioepiteliali che si spostano verso un fenotipo mesenchimale, mostrata dalla perdita di espressione CK14, CK5/6 e p63, è stata rafforzata dall’etichettatura discontinua delle cellule del fuso per Alfa-SMA, un marker di entrambe le cellule mioepiteliali e miofibroblasti, che è stata completamente persa in cellule mobili stellate che sono presumibilmente diventate fibroblasti.

Ulteriori studi di conferma di Tsuda et al. riportato il verificarsi di miofibroblasti con resti di espressione CK14 (descritto come “cellule mioepiteliali convertite”). Nei casi esaminati nel presente studio, CK14 si è progressivamente sbiadito, indicando quindi una perdita del fenotipo (myo-)epiteliale. Questi risultati supportano l’ipotesi EMT che coinvolge uno stato simile al mioepiteliale, che subisce una transizione mesenchimale mioepiteliale (MMT). Questa ipotesi è stata confermata nel cane da Gärtner et al. l’oms ha affermato che nei tumori mammari uno dei passaggi nell’evoluzione delle cellule mesenchimali comporta l’espressione di tipici tratti mioepiteliali.

Un risultato interessante del presente studio è stata la positività a ER trovata in 12/29 cellule mioepiteliali soprabasali e 9/29 cellule stellate di carcinoma in tumori benigni-misti e carcinomi complessi. Sono state descritte due isoforme di recettori ER, vale a dire ER-α ed ER-β, quest’ultima è l’unica forma espressa nei nuclei di cellule basali-mioepiteliali isolate . L’anticorpo utilizzato nella presente indagine era comprensivo di entrambe le isoforme: sia le cellule luminali che quelle basali/stellate erano etichettate, presumibilmente le cellule luminali da ER-α e le cellule basali/stellate da ER-β.

In conclusione, le cellule mioepiteliali soprabasali erano ben caratterizzate da p63 e CK14 e in misura minore dall’altro marker utilizzato. Le cellule mioepiteliali mobili sono invece caratterizzate da Alfa-SMA e VIM e perdita di CK14, CK5/6 e p63 (Figura 2). Il presente studio ha anche dimostrato ER sia nelle cellule epiteliali luminali che soprabasali/stellate mioepiteliali (queste ultime in circa la metà dei casi) e che l’espressione ER non è influenzata dalla fase di riposo/motile. Pertanto, nelle sezioni seriali o multistained, l’immunoistochimica a ER in combinazione con p63 e CK14 può servire per evitare l’identificazione errata di cellule luminali o mioepiteliali nei tumori mammari canini. La tendenza dell’espressione di Alfa-SMA e VIM conservata nelle cellule del fuso e solo la positività di VIM nelle cellule mobili stellate, nonché la diminuzione dell’espressione di p63 in entrambi i tipi mobili, supporta l’ipotesi dell’EMT che coinvolge uno stato mioepiteliale in MMT. La cellula mobile del fuso potrebbe essere considerata una trasformazione precedente rispetto alla cellula stellata verso un fenotipo mesenchimale.

Contributo degli autori

Questi autori hanno contribuito ugualmente a questo lavoro.

Conflitto di interessi

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Riconoscimento

Gli autori ringraziano la signora Anne Collins per aver modificato il testo in inglese.

Materiali supplementari