il Regolamento di Cardiaco Reticolo Endoplasmatico Assorbimento di Ca2+ dai Phospholamban

Nei primi anni 1970, una scoperta è stata segnalata da Arnold Katz (Tada et al1 ), che ha dimostrato che la fosforilazione di cardiaco isolato reticolo endoplasmatico membrane si è verificato principalmente a basso peso molecolare della proteina. Questa fosfoproteina è stata chiamata phospholamban, dalle parole della radice greca che significano ” ricevere fosfato.”1 Phospholamban è una piccola proteina, comprendente 52 residui di aminoacidi, ed è presente nei muscoli scheletrici cardiaci, lisci e a contrazione lenta. Tuttavia, i suoi effetti regolatori sono stati studiati principalmente nel muscolo cardiaco. Studi in vitro hanno indicato che il fosfolambano può essere fosforilato in tre siti distinti da varie protein chinasi: serina 10, dalla protein chinasi C; serina 16, dalla protein chinasi cAMP – o cGMP-dipendente; e treonina 17, dalla protein chinasi Ca2+-calmodulina–dipendente.23 Ogni fosforilazione è associata alla stimolazione dei tassi iniziali di assorbimento del reticolo sarcoplasmatico cardiaco Ca2+, che è principalmente pronunciato a basso, con conseguente aumento complessivo dell’affinità della pompa Ca2+ per Ca2+.45 Sulla base di queste osservazioni, è stato inizialmente ipotizzato che il fosfolambano fosforilato funzioni come stimolatore dell’enzima Ca2+-ATPasi (SERCA2) del reticolo sarcoplasmatico cardiaco. Tuttavia, alla fine del 1980, si è verificato un significativo passo avanti dimostrando che il fosfolambano defosforilato è in realtà un inibitore del trasporto Ca2+ del reticolo sarcoplasmatico cardiaco per Ca2+ e che la fosforilazione allevia questo effetto inibitorio, dando l’apparenza di stimolazione indotta dalla fosforilazione.6 Questa scoperta, insieme all’identificazione di una fosfatasi proteica associata al reticolo sarcoplasmatico cardiaco che può defosforilare il fosfolambano,7 ha portato alla nostra attuale comprensione del fosfolambano come inibitore reversibile dell’attività Ca2+ ATPasi del reticolo sarcoplasmatico cardiaco.

Il fosfolambano è anche fosforilato in situ durante la stimolazione β-adrenergica. Studi su cuori battenti intatti o miociti cardiaci isolati hanno dimostrato che sia la serina 16 che la treonina 17 nel fosfolambano diventano fosforilati durante la stimolazione dell’isoproterenolo.89 La fosforilazione del fosfolambano e gli aumenti accompagnati nei tassi di assorbimento Ca2+ del reticolo sarcoplasmatico cardiaco sono stati suggeriti per essere almeno parzialmente responsabili degli effetti stimolatori dei β-agonisti nel cuore dei mammiferi.

Caratteristiche strutturali del fosfolambano

La struttura del fosfolambano non è attualmente nota, ma sulla base della sua sequenza aminoacidica, sono stati proposti diversi modelli. È generalmente accettato che ci siano due domini principali: un dominio idrofilo (AA 1-30, indicando residui di amminoacidi da 1 a 30), che contiene i tre siti di fosforilazione, e un dominio idrofobo (AA 31-52), che è ancorato nella membrana del reticolo sarcoplasmatico cardiaco. Parte del dominio idrofilo è stato suggerito di essere in una configurazione elicoidale e la fosforilazione del fosfolambano può svolgersi o interrompere questa configurazione strutturale.10 Prove da diversi laboratori hanno indicato l’importanza del dominio idrofilo nel mediare gli effetti regolatori del fosfolambano sulla pompa Ca2+ del reticolo sarcoplasmatico cardiaco.6111213 In realtà, AA 2-18 in fosfolambano sono stati suggeriti di interagire con AA 336-412 e 467-762 in SERCA2 per la modifica funzionale.14

Il dominio idrofobo del fosfolambano è stato anche proposto per avere una struttura elicoidale. Non vi è attualmente alcuna prova chiara che questo dominio interagisca con la pompa Ca2+ del reticolo sarcoplasmatico cardiaco, sebbene diversi studi abbiano suggerito che la porzione idrofobica di fosfolambano è anche importante nel mediare gli effetti regolatori.1215 I residui di cisteina nel dominio transmembrana α-elicoidale forniscono un’interazione non covalente tra forme monomeriche e contribuiscono alla stabilizzazione di una struttura pentamericana per il fosfolambano.16 L’analisi dei pentameri fosfolambani indicava che la formazione di pentameri era quella di un fascio elicoidale a spirale mancino, con un poro ionico cilindrico.17 Prove recenti hanno dimostrato che una cerniera leucina stabilizza l’associazione pentamerica fosfolambano e forma un poro ionico centrale,18 che può consentire il trasferimento di ioni Ca2+-selettiva.19 Tuttavia, non è attualmente chiaro se l’assemblaggio pentamerico sia essenziale per la regolazione funzionale del reticolo sarcoplasmatico cardiaco Ca2+ ATPasi. Studi di espressione in sistemi cell free hanno indicato che le forme monomeriche e pentamericane di fosfolambano sono ugualmente efficaci nel mediare gli effetti regolatori sulla pompa Ca2+.14

Un’altra teoria sull’interazione fosfolambano–Ca2+-ATPasi ha proposto un’associazione dimerica delle proteine della pompa Ca2+ attorno a un pentamero fosfolambano.20 Questo modello, basato sull’anisotropia a fosforescenza risolta nel tempo, ha descritto un’interazione preferenziale tra la pompa senza Ca2+e il fosfolambano defosforilato. Fosfolamban fosforilazione destabilizzato l’interazione e ha portato ad una maggiore mobilità rotazionale della Ca2+-ATPasi nella membrana del reticolo sarcoplasmatico cardiaco.20

Regolazione della contrattilità miocardica basale da parte del fosfolambano

Il ruolo del fosfolambano nella regolazione della contrattilità miocardica basale è stato recentemente chiarito attraverso lo sviluppo di un topo con carenza di fosfolambano.21 Questi topi, creati utilizzando la metodologia del gene-targeting nelle cellule staminali embrionali murine, hanno mostrato una funzione cardiaca iperdinamica, tra cui un aumento della funzione sistolica,un aumento dei tassi di rilassamento ventricolare sinistro, 21 e un maggiore riempimento ventricolare.22 I cuori con deficit di fosfolambano non solo si rilassavano più velocemente dei cuori di tipo selvaggio, ma mostravano anche parametri inotropi migliorati, tra cui un aumento dei tassi di sviluppo della pressione, che sono stati valutati in preparazioni di esecuzione del lavoro21 e in vivo, utilizzando analisi ecocardiografiche.22 Questi risultati sono stati convalidati da analisi in vitro di cardiomiociti ventricolari isolati da cuori privi di fosfolambano, che hanno anche mostrato un miglioramento dei tassi di relengthening, accorciamento e cinetica Ca2+.23 I parametri contrattili migliorati riflettevano alterazioni subcellulari a livello del reticolo sarcoplasmatico cardiaco. L’affinità della pompa Ca2 + per Ca2 + è stata significativamente aumentata e ciò è stato associato ad un aumento del contenuto di Ca2+ del reticolo sarcoplasmatico cardiaco intraluminale nei cuori privi di fosfolambano rispetto ai cuori di tipo selvaggio.21

L’importanza funzionale del fosfolambano nella regolazione della contrattilità cardiaca è stata ulteriormente dimostrata in studi su topi eterozigoti fosfolambani, che contengono solo un allele mirato al fosfolambano.24 I cuori di questi topi esprimono il 40% dei livelli di fosfolambano presenti nei cuori di topo wild-type e questa ridotta espressione di fosfolambano è associata ad aumenti dell’affinità del sistema di trasporto del reticolo sarcoplasmatico cardiaco Ca2+ per Ca2+ e aumenti dei parametri contrattili. È interessante notare che quando i livelli di fosfolambano nei cuori wild-type, phospholamban-eterozigoti e phospholamban-carenti sono stati tracciati contro i tassi di contrazione e rilassamento per questi cuori, c’è stata una stretta correlazione lineare osservata (Fig 1), suggerendo un ruolo prominente per phospholamban nella regolazione dei parametri contrattili basali nel cuore dei mammiferi. Inoltre, poiché i livelli del reticolo sarcoplasmatico cardiaco Ca2 + ATPasi non sono stati influenzati in questi cuori geneticamente alterati,25 questi dati indicano che le alterazioni dei livelli di fosfolambano, che possono riflettere alterazioni della stechiometria relativa del fosfolambano al reticolo sarcoplasmatico cardiaco Ca2 + ATPasi, sono associate ad alterazioni parallele nei parametri contrattili cardiaci. Tuttavia, la stechiometria funzionale del fosfolambano al reticolo sarcoplasmatico cardiaco Ca2+ ATPasi non è attualmente nota. Studi in vitro hanno riportato valori variabili tra 1: 5 e 5:1 per fosfolambano / SERCA2. Studi in vivo con topi transgenici, che sovraesprimono il fosfolambano specificamente nel cuore, hanno suggerito che la” stechiometria funzionale ” di fosfolambano/SERCA2 è inferiore a 1:1 nelle membrane del reticolo sarcoplasmatico cardiaco nativo.26 I livelli di proteine di fosfolambano nei cuori di questi topi transgenici erano due volte più alti rispetto ai cuori di tipo selvaggio e l’aumentata espressione di fosfolambano ha determinato una maggiore inibizione dell’affinità Ca2+-ATPasi per Ca2+, senza alcun effetto sulla Vmax di questo enzima.26 Inoltre, quando i livelli relativi di phospholamban per la cardiochirurgia reticolo endoplasmatico Ca2+ Atpasi sono stati tracciati in base ai valori di EC50 del Ca2+-Atpasi di Ca2+ in phospholamban sovraespressione di wild-type, phospholamban eterozigoti, e deficit di phospholamban cuore, c’era una stretta correlazione lineare osservato (Fig 2), che indica che il overexpressed phospholamban nei cuori transgenici era funzionalmente accoppiati per il Ca2+-Atpasi. La ridotta affinità della Ca2 + – ATPasi per Ca2 + nei cuori di sovraespressione fosfolambana è stata associata a diminuzioni dei parametri contrattili e depressione dei transitori Ca2+ nei miociti cardiaci isolati rispetto ai miociti dei cuori di tipo selvaggio.26 Analisi ecocardiografiche di cuori di questi topi transgenici hanno dimostrato accorciamento frazionario e accorciamento circonferenziale significativamente soppresso rispetto ai cuori di topi wild-type.26 Presi insieme, questi studi su topi geneticamente modificati indicano che il fosfolambano è un potente repressore dei parametri di contrazione e rilassamento nel cuore dei mammiferi.

Il ruolo del fosfolambano nella reattività β-adrenergica miocardica

Gli studi in cuori battenti isolati e miociti cardiaci hanno dimostrato che la somministrazione di catecolammina provoca la fosforilazione del fosfolambano nel reticolo sarcoplasmatico cardiaco, il fosfolemmano nelle membrane sarcolemmali e la proteina troponina I e C nelle miofibrille. Tuttavia, i tassi di reazioni di fosforilazione/defosforilazione sul fosfolambano sembrano essere più veloci di quelli delle altre fosfoproteine e il fosfolambano è stato suggerito per essere un mediatore prominente delle risposte β-adrenergiche nel cuore dei mammiferi. La fosforilazione del fosfolambano, in risposta agli aumenti dei livelli di cAMP durante la somministrazione di β-agonista, è accompagnata da aumenti dell’attività del sistema di trasporto Ca2+ del reticolo sarcoplasmatico cardiaco e da un aumento dei tassi di rilassamento cardiaco.272829 L’aumento dei tassi di assorbimento di Ca2 + porta ad un aumento dei livelli di sequestro del reticolo sarcoplasmatico cardiaco Ca2+, che sono disponibili per le contrazioni successive, portando ad un aumento della forza contrattile. Tuttavia, il fosfolambano non è solo fosforilato dalla protein chinasi CAMP-dipendente sulla serina 16, ma anche dalla protein chinasi Ca2+-calmodulina sulla treonina 17,89 e il contributo relativo di ciascuna fosforilazione negli effetti inotropi e lusitropici dei β-agonisti non è attualmente noto.

Il ruolo funzionale di phospholamban nella via di segnalazione β-adrenergica è stato recentemente chiarito facendo uso del topo phospholamban-carente. Studi in vitro su miociti isolati e preparati cardiaci di questi topi hanno indicato una significativa attenuazione degli effetti inotropi e lusitropici dell’isoproterenolo rispetto ai preparati wild-type.2123 Inoltre, studi in vivo utilizzando analisi ecocardiografiche di cuori ablati di fosfolambano hanno dimostrato che gli effetti stimolanti β-adrenergici erano attenuati anche nell’animale intatto.22 Pertanto, sebbene il fosfolambano non sia l’unica proteina coinvolta nella trasduzione della segnalazione β-adrenergica cardiaca, le prove sperimentali fino ad oggi indicano che è una delle principali. La funzione del fosfolambano durante la stimolazione della catecolamina del cuore suggerisce un ruolo per questa proteina come un “meccanismo di freno” interno, che consente una rapida reazione miocardica, tale che quando l’adrenalina viene rilasciata su una situazione di “lotta o fuga”, il” freno ” del fosfolambano viene alleviato, consentendo rapidi aumenti della contrazione cardiaca e del rilassamento.

Regolazione dell’espressione del fosfolambano

Il fosfolambano è il prodotto di un singolo gene ed è stato clonato da diverse specie tra cui maiale, pollo, topo e umano. C’è>omologia del 96% tra le regioni codificanti del gene del fosfolambano tra queste specie e non sono state rilevate isoforme di fosfolambano fino ad oggi.30 Il gene phospholamban è stato mappato sul cromosoma umano 6.31 Studi nel topo hanno dimostrato che per quanto riguarda il sistema circolatorio, il fosfolambano è espresso in modo differenziato, che va da alti livelli di espressione nel muscolo ventricolare, a livelli intermedi nei muscoli del miocardio atriale e polmonare e a livelli bassi ma funzionalmente significativi di espressione nella muscolatura liscia aortica. I livelli differenziali di espressione di fosfolambano nei compartimenti ventricolari e atriali sembravano correlare con le differenze nei parametri contrattili di questi muscoli.32

L’espressione del fosfolambano ha anche dimostrato di essere regolata durante lo sviluppo e l’invecchiamento. Aumenti dell’espressione di fosfolambano nel corso dello sviluppo cardiaco sono stati osservati nel topo, nel pollo, nel ratto e nel coniglio.31323334 Inoltre, i decrementi nella fosforilazione di fosfolambano nel cuore del ratto che invecchia sono stati suggeriti per essere associati a risposte contrattili diminuite di questi cuori alla stimolazione delle catecolamine.è stato inoltre dimostrato che l’espressione del fosfolambano miocardico è regolata dallo stato tiroideo sia nel ratto che nel coniglio.3435 Durante l’ipotiroidismo, i livelli di mRNA di fosfolambano non sono stati modificati nell’atrio e nel ventricolo del coniglio, mentre i livelli di proteine di fosfolambano sono aumentati nei cuori dei ratti. Questi livelli elevati di fosfolambano nel cuore del ratto sono stati associati a una diminuzione dei tassi di assorbimento del reticolo sarcoplasmatico cardiaco Ca2+, coerente con una maggiore inibizione della pompa del reticolo sarcoplasmatico cardiaco Ca2+ e una diminuzione della contrattilità.34 Effetti regolatori opposti sono stati osservati per l’espressione di fosfolambano durante l’ipertiroidismo.3435 L’ipertiroidismo è stato associato a una diminuzione dei livelli di mRNA di fosfolambano negli atri e nei ventricoli del coniglio e a una diminuzione dei livelli di proteina fosfolambano nei cuori di ratto. Le diminuzioni dei livelli di fosfolambano sono state riflesse da un aumento dei tassi di assorbimento del reticolo sarcoplasmatico cardiaco Ca2+, coerente con la disinibizione della pompa Ca2+ e il miglioramento dei parametri contrattili.

Recenti indagini sulle alterazioni dell’espressione genica, che si verificano durante l’insufficienza cardiaca, hanno indicato che le alterazioni del rapporto relativo tra fosfolambano e SR Ca2+ ATPasi possono essere un segno distintivo di questa malattia.363738 Tuttavia, vi è una certa discrepanza all’interno della letteratura su come l’espressione del fosfolambano viene alterata durante l’insufficienza miocardica. Alcuni studi condotti in mancanza di cuori umani hanno dimostrato riduzioni del fosfolambano mRNA37 o della proteina fosfolambano, 363738 mentre altri studi non hanno osservato alterazioni apparenti nei livelli di fosfolambano dei cuori umani in mancanza.39404142 Sebbene continuino ad esserci controversie riguardo alle alterazioni del fosfolambano durante l’insufficienza cardiaca, è chiaro che le alterazioni intracellulari, che sono associate alla repressione della contrattilità cardiaca, suggeriscono un ruolo del fosfolambano nell’eziologia della malattia.

Sommario

La nostra comprensione del ruolo del fosfolambano nella fisiologia cardiaca si è evoluta negli ultimi due decenni al punto in cui questa proteina è ora intesa come un repressore critico della contrattilità miocardica. Il fosfolambano, attraverso i suoi effetti inibitori sull’affinità della pompa Ca2+ del reticolo sarcoplasmatico cardiaco per Ca2+, reprime sia i tassi di rilassamento che di contrazione nel cuore dei mammiferi. Questi effetti inibitori possono essere alleviati attraverso (1) fosforilazione di fosfolambano, (2) downregulation dell’espressione genica di fosfolambano e (3) interruzione dell’interazione fosfolambano–Ca2+-ATPasi. Pertanto, approcci genetici e interventi farmacologici, progettati per alleviare l’azione inibitoria del fosfolambano sulla pompa Ca2+ del reticolo sarcoplasmatico cardiaco e il rilassamento del miocardio, possono rivelarsi utili per invertire gli effetti di diverse malattie nel cuore dei mammiferi. Tali interventi potrebbero essere progettati per inibire la fosfolamban fosfatasi, stabilizzare lo stato fosforilato di fosfolamban, interrompere l’interazione fosfolamban-Ca2+-ATPasi, diminuire la trascrizione fosfolamban o interrompere la stabilità dell’mRNA fosfolamban. Lo sviluppo di tali strategie terapeutiche per indirizzare phospholamban sarà un obiettivo futuro importante per il miglioramento clinico di contrattilità nel cuore fallente.

Note a piè di pagina