I batteri gram-negativi, come gli organelli energetici di piante e animali (il cloroplasto e i mitocondri), hanno due strati di membrana chiamati membrane esterne e interne. Lo spazio tra queste due membrane è chiamato il periplasma. Molto prima degli eucarioti unicellulari, il periplasma si è evoluto come primo compartimento extracitoplasmatico per fornire un importante adattamento competitivo ai batteri gram-negativi. La conoscenza precoce e la scoperta del periplasma si sono sviluppate anche prima della sua visualizzazione morfologica. Nel 1960, gli scienziati stavano cercando di capire come enzimi tossici coinvolti nella degradazione di importanti molecole biologiche, come ribonucleasi e fosfatasi prodotte dai batteri gram-negativi Escherichia coli, non erano tossici per la cellula. I metodi di estrazione biochimica suggerivano un compartimento separato, perché tale estrazione conservava il citoplasma interno legato alla membrana, e questi sferoplasti potevano crescere di nuovo e sintetizzare più enzimi . Lo sviluppo della microscopia elettronica ha portato alla visualizzazione dei due strati di membrana separati dal periplasma .

La membrana aggiuntiva consente la creazione del periplasma come un compartimento cellulare separato le cui nuove funzioni probabilmente hanno fornito un vantaggio selettivo significativo e forse ancora più importante rispetto all’esclusione delle tossine (Tabella 1). Queste nuove funzioni includono il trasporto di proteine, la piegatura, l’ossidazione e il controllo di qualità simili al reticolo endoplasmatico delle cellule eucariotiche. Il periplasma inoltre tiene conto il sequestro degli enzimi che possono essere tossici nel citoplasma, nelle funzioni importanti di segnalazione e nella regolazione di divisione cellulare. Inoltre, contribuisce alla capacità della cellula di resistere alla pressione del turgore fornendo sistemi strutturali che funzionano in concerto con la membrana esterna, come peptidoglicano e lipoproteine, sistemi di efflusso multidrug e soluti specifici che contribuiscono a un potenziale Donnan o ionico attraverso la membrana esterna. Il periplasma contiene anche le piattaforme di assemblaggio coinvolte nella secrezione di proteine beta-barrel, lipoproteine e glicerolfosfolipidi dalla struttura unica alla membrana esterna (Fig 1).

Mostrato è il doppio strato asimmetrico di lipopolisaccaride e glicerolfosfolipidi che compongono la membrana esterna. La membrana interna è un doppio strato simmetrico di glicerolfosfolipidi. Lo spazio periplasmico è la regione tra queste membrane che include una varietà di enzimi e funzioni, tra cui l’ossidazione e il controllo di qualità delle proteine. Anche all’interno dello spazio periplasmico è uno strato di zuccheri reticolati e aminoacidi chiamati peptidoglicano, che circonda la cellula. Il peptidoglicano è collegato alla membrana esterna nei batteri enterici attraverso legami covalenti transpeptidasi tra un’abbondante lipoproteina della membrana esterna Lpp. Una varietà di sensori siedono nella membrana interna con domini periplasmici che rilevano cambiamenti ambientali e, nel caso del sistema Rcs, un cambiamento nella posizione della lipoproteina della membrana esterna RcsF. Complessi proteici multicomponenti come la macchina flagellare coprono le due membrane. IM, membrana interna; Lpp, lipoproteina di Braun; LPS, lipopolisaccaride; RcsF, Regolatore della sintesi della capsula F.

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La membrana esterna è un organello unico collegato ad altre parti dell’involucro cellulare tramite il periplasma. I batteri gram-positivi mancano di una membrana esterna ma hanno un polimero peptidoglicano più esteso che protegge la loro superficie. In contrasto con la membrana interna batterica-che è un doppio strato di glicerolfosfolipidi simile a quella della maggior parte delle membrane dei mammiferi e che ha un flusso specifico caratterizzato da diffusione laterale—la membrana esterna ha un flusso limitato . È un doppio strato unico, con il volantino interno che ha un tipico contenuto di glicerolfosfolipidi di fosfotidiletanolammina, fosfatidilglicerolo e cardiolipina e il volantino esterno in gran parte composto da un glicolipide unico, lipopolisaccaride (LPS) . I fosfati LPS conferiscono una carica negativa alla superficie e uno specifico potenziale Donnan viene creato attraverso la membrana esterna nel periplasma . La membrana esterna funziona come una barriera selettiva che consente il trasporto di nutrienti preziosi fornendo una barriera contro i composti tossici, come i composti antimicrobici cationici prodotti da tutti gli organismi, compresi molti batteri gram-positivi . Un altro componente di questa barriera sono le proteine della membrana esterna con una struttura unica del beta-barilotto che sono inserite nella membrana esterna attraverso un sistema specifico del chaperone periplasmico . Queste proteine si assemblano nella membrana esterna come puncta specifico, indicando che la membrana esterna probabilmente si assembla in specifiche patch discrete contenenti proteine e l’unico doppio strato lipidico asimmetrico . Incluse tra queste proteine della membrana esterna sono le porine, che possono agire come canali selettivi che consentono substrati idrofili di una dimensione specifica ingresso al periplasma. Fortunatamente per gli esseri umani, queste porine trasportano antibiotici beta-lattamici idrofili, che consentono la loro penetrazione nel periplasma, dove mirano alla sintesi dell’importante elemento strutturale della parete cellulare—il peptidoglicano polimerico. La membrana esterna in alcuni batteri è ancorata al polimero peptidoglicano attraverso abbondanti lipoproteine, che vengono inserite nel foglietto interno della membrana esterna attraverso specifici sistemi di secrezione . Una varietà di importanti complessi proteici funzionano come nanomacchine e utilizzano l’idrolisi dell’ATP per secernere macromolecole o trasformare un organello motilità chiamato flagelli . Pertanto, la membrana esterna e la membrana interna sono anche collegate attraverso il periplasma da complessi proteici che coprono la membrana. Quindi, la membrana esterna è composta da patch distintamente assemblate che comprendono un organello complesso che può essere collegato allo strato di peptidoglicano e alla membrana interna attraverso legami proteici covalenti e non covalenti. L’assemblaggio della membrana esterna e il suo collegamento al peptidoglicano e al citoplasma creano uno spazio tra la membrana interna e la membrana esterna, che è il periplasma.

Nonostante le importanti funzioni contenute nello spazio periplasmico, per molti anni si è discusso della distanza intermembrana o delle dimensioni di questo compartimento e se vi sia uniformità di spaziatura tra le membrane interne ed esterne in tutta la cellula. C’era preoccupazione che molte delle visualizzazioni di questo spazio come di una dimensione specifica fossero artefatti di fissazione per l’imaging mediante microscopia elettronica e che, in realtà, lo spazio fosse in realtà solo uno spazio potenziale. I primi studi al microscopio elettronico di Bayer dimostrarono aderenze tra la membrana esterna e quella interna che cancellavano parte di questi spazi; suggerì che i punti di adesione erano aree in cui il principale lipide esterno, LPS, veniva consegnato alla membrana esterna dal suo sito di sintesi alla membrana interna . Tuttavia, il suo lavoro è stato successivamente screditato come derivato dall’osservazione di potenziali artefatti di fissazione, anche se molti esperti oggi pensano che ci possano essere vere aderenze proteiche tra le membrane perché alcuni sistemi di efflusso e trasporto non contengono componenti di dimensioni sufficienti per coprire lo spazio visualizzato. La presenza di aree specifiche in cui le membrane sono vicine spiegherebbe come potrebbero funzionare alcune di queste pompe di trasporto e di efflusso a cassetta (ABC) che legano ATP; questi sistemi hanno componenti proteici periplasmici che sono essenziali per l’efflusso, LPS o altri trasporti di glicolipidi, ma mancano di una dimensione intrinseca o di una natura polimerica abbastanza grande da raggiungere la membrana esterna e quindi fornire un meccanismo per promuovere il trasporto. Inoltre, il periplasma contiene molti altri componenti che richiedono almeno un certo volume per lo spazio periplasmico, più prominente lo strato polimerico peptidoglicano che circonda la cellula. Allo stato attuale, non è chiaro come questi trasportatori ottenere intorno a questo polimero e la larghezza di periplasm a contatto con la membrana, anche se il recente lavoro dimostrando che la membrana esterna delle lipoproteine in grado di coordinare sintesi del peptidoglicano attraverso il contatto diretto indica che almeno alcune proteine possono adattarsi attraverso i pori del peptidoglicano per realizzare importanti funzioni

al contrario, una varietà di organelli, tra cui il flagello e la virulenza associati Tipo sistema di secrezione di III ago complessi, richiedono il montaggio di polimeri all’interno periplasm che abbracciano i due membrane. Nel caso del flagello, la sua asta o albero di trasmissione attraversa il periplasma e la sua lunghezza è determinata dal polimero che contatta la membrana esterna. Un elegante lavoro recente del gruppo di Kelly Hughes ha dimostrato che la dimensione del periplasma, o la distanza tra le due membrane, è controllata in gran parte nei batteri enterici da una lipoproteina specifica chiamata lipoproteina di Braun (o Lpp), che collega covalentemente la membrana esterna allo strato di peptidoglicano . Questo è abbastanza notevole perché Lpp è la proteina più abbondante presente nei batteri enterici, descritta da Braun 48 anni fa, e fino a questo punto nessuna funzione specifica era stata attribuita ad esso. Questa proteina alfa-elicoidale viene inserita attraverso il suo ancoraggio lipidico nel foglio interno della membrana esterna e legata covalentemente al polimero peptidoglicano da una famiglia di transpeptidasi . L’allungamento di queste lipoproteine che consentono l’espansione del periplasma porta a un’asta flagellare più lunga e un comportamento di nuoto più efficiente. Questi autori hanno interpretato questo risultato come indicante che ci devono essere altre funzioni evolutivamente selezionate che hanno limitato la dimensione periplasmica, costringendo a ridurre l’efficienza del nuoto. In questo numero di PLOS Biology, viene rivelata una di quelle funzioni importanti: una funzione di segnalazione del danno dell’involucro controllata da un’altra lipoproteina della membrana esterna, Regolatore della sintesi della capsula F (RcsF), che percepisce il disturbo o il danno dell’involucro.

I batteri gram-negativi hanno una varietà di funzioni importanti che percepiscono danni alla membrana e composti tossici, come i peptidi antimicrobici, che danneggiano la membrana esterna . Questi sistemi di rilevamento includono quelli che permettono rimodellamento della superficie batterica per essere più resistente ai composti tossici-analogo a astronavi energizzare i loro scudi in storie di fantascienza . Alcuni di questi sistemi di rilevamento sono recettori che funzionano come chinasi del sensore con domini nel periplasma per rilevare molecole o danni specifici. Tuttavia, uno dei sistemi più singolari della chinasi del sensore, denominato il sistema di Rcs-che sul danno della membrana attiva la sintesi del polisaccaride extracellulare per fornire la protezione cellulare e la formazione del biofilm-ha una lipoproteina esterna della membrana RcsF, che interagisce con le proteine di segnalazione con i domini periplasmici specifici sul danno dell’inviluppo e sullo sforzo del peptidoglicano per attivare Pertanto, il danno all’involucro porta in qualche modo la lipoproteina RcsF in maggiore vicinanza al sistema di rilevamento della membrana interna, e quindi si è evoluto in un disturbo del senso nella membrana esterna e/o nel peptidoglicano (Fig 2). In questo numero della rivista PLOS Biology, gli autori hanno definitivamente dimostrato che la sensazione si richiede periplasm di essere una specifica dimensione, in quanto le mutazioni che allungano i molto abbondante Lpp lipoproteine ancora dalla membrana esterna al peptidoglicano (con conseguente aumento di dimensione dei periplasm) ha abolito la segnalazione, a meno che il rilevamento delle lipoproteine (che in danno di membrana deve raggiungere la membrana interna del sensore) è anche allungata . Questo lavoro mostra anche chiaramente un ordine e una dimensione molto specifici per il periplasma; la dimensione del periplasma è chiaramente vista come esiste in associazione con i cambiamenti nell’ancoraggio o nella lunghezza delle lipoproteine mediante microscopia crio-elettronica. Questa tecnologia e la tomografia elettronica utilizzata nel lavoro del gruppo Hughes in relazione al rotore flagellare stanno rivoluzionando la nostra visione dell’involucro cellulare batterico e dei complessi proteici che coprono il periplasma per svolgere funzioni importanti .

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Fig 2. La segnalazione RcsF è alterata da un cambiamento nelle dimensioni dello spazio periplasmico.

Il sensore per lipoproteine a membrana esterna RcsF deve contattare i partner di segnalazione della membrana interna per attivare il rilevamento. Questo rilevamento richiede una distanza periplasmica specifica perché l’allungamento dei legami Lpp al peptidoglicano aumenta la distanza del periplasma e, a meno che RcsF non sia allungato, la segnalazione non può più verificarsi. Nel pannello A: lo stato in cui RcsF non attiva la segnalazione perché non è in corso alcun disturbo della busta. Nel pannello B: il disturbo della busta porta a interazioni fisiche RcsF con il sistema di rilevamento della membrana interna e il regulon Rcs viene attivato. Nel pannello C, in cui Lpp è stato allungato e la distanza intermembrana periplasmica allungata, il regulon Rcs non può essere attivato nonostante il disturbo dell’inviluppo. Nel pannello D: il difetto del Lpp lungo viene corretto allungando RcsF. IM, membrana interna; Lpp, lipoproteina di Braun; OM, membrana esterna; PG, peptidoglicano; RcsF, Regolatore della sintesi della capsula F.

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anche Se questi studi recenti hanno definito Lpp come molecolari specifici righello tra la membrana esterna e peptidoglicano, non si sa che cosa regola la distanza tra la membrana interna e peptidoglicano e ciò che controlla la polimerizzazione o la degradazione del peptidoglicano polimero, in modo che non ostruiscano le proteine che attraversano la periplasm. Definire questi e altri misteri dell’involucro cellulare potrebbe portare a importanti progressi pratici oltre a soddisfare la nostra spinta scientifica a risolvere i misteri dell’involucro cellulare batterico gram-negativo. Questo involucro è un setaccio molecolare notevolmente efficiente ed evolutivamente avanzato che rende lo sviluppo di antibiotici contro questi organismi molto più difficile rispetto ai batteri gram-positivi, che mancano della membrana e del periplasma aggiuntivi.

Una maggiore conoscenza dell’involucro cellulare gram-negativo è anche fondamentale per comprendere i meccanismi della resistenza agli antibiotici perché molti dei nostri antibiotici di maggior successo, inclusi gli antibiotici beta-lattamici (che mirano al peptidoglicano ed entrano attraverso le porine), mirano all’involucro cellulare. I batteri gram-negativi e gli organismi multiresistenti continuano ad evolversi attraverso mutazioni dell’involucro e l’acquisizione di nuovi enzimi periplasmici. C’è una mancanza di nuovi antibiotici per i batteri gram-negativi nella pipeline a causa della difficoltà di violare la barriera unica fornita dalla membrana esterna e dal periplasma. A questo proposito, gli antibiotici con obiettivi periplasmici hanno un vantaggio rispetto a quelli affrontati con le difficoltà di penetrare nella membrana interna ed evitare un efflusso significativo. È interessante ipotizzare che il targeting di funzioni periplasmiche essenziali che richiedono un periplasma di dimensioni specifiche e capacità di ospitare funzioni diverse potrebbe offrire nuovi importanti obiettivi per lo sviluppo di antibiotici. Studi recenti hanno scoperto nuove funzioni di base dell’involucro gram-negativo attraverso la genetica batterica, la biologia strutturale e le tecniche morfologiche avanzate. Nonostante decenni di studio, molto resta da imparare sull’involucro cellulare batterico gram-negativo. Scoprire altri misteri in questo settore dovrebbe portare a una nuova generazione di obiettivi per lo sviluppo di antibiotici per tenerci un passo avanti nella corsa agli armamenti con batteri gram-negativi resistenti agli antibiotici.