La fontana della giovinezza: un racconto di parabiosi, cellule staminali e ringiovanimento | Company Pride
2. A tale of parabiosis
L’affermazione che il sangue può ringiovanire i nostri organi è stata rivitalizzata da un gruppo di ricerca presso la Stanford University School of Medicine nel 2005 e nel 2010 . Questi studi sono nati da osservazioni che mostrano che la capacità rigenerativa dei tessuti diminuisce con l’età. Nei tessuti quali il muscolo, il sangue, il fegato ed il cervello questo declino è stato attribuito ad una risposta diminuita dello stelo tessuto-specifico e delle cellule progenitrici . Tuttavia, il muscolo invecchiato rigenera con successo una volta innestato nel muscolo in un ospite giovane, ma il muscolo giovane visualizza la rigenerazione alterata una volta innestato in un ospite invecchiato . Fattori locali o sistemici potrebbero essere responsabili di questi effetti reciproci. Al fine di verificare se i fattori sistemici possono supportare la rigenerazione dei tessuti negli animali giovani e/o inibire la rigenerazione negli animali vecchi, il documento di Conboy e colleghi di 2005 ha riportato un setup sperimentale in cui – a differenza del trapianto – i tessuti rigeneranti negli animali invecchiati sono esposti solo a fattori circolanti di animali giovani e viceversa . Così, hanno stabilito abbinamenti parabiotici tra topi giovani e vecchi (parabios eterocronici), con abbinamenti parabiotici tra due topi giovani o due vecchi topi (parabios isocronici) che fungono da controlli (Fig. 1). Nella parabiosi, due topi sono uniti chirurgicamente, in modo tale da sviluppare una circolazione sanguigna condivisa con uno scambio rapido e continuo di cellule e fattori solubili a livelli fisiologici attraverso il loro sistema circolatorio comune . La parabiosi fu inventata nel 1864 dal fisiologo Paul Bert per vedere se fu creato un sistema circolatorio condiviso. Clive McCay, un biochimico e gerontologo presso la Cornell University di Ithaca, New York, è stato il primo ad applicare parabiosis per lo studio dell’invecchiamento, ma questa tecnica è caduto in disgrazia dopo il 1970, probabilmente perché molti ratti morti da un misterioso condizione definita parabiotic malattia, che si verifica circa una o due settimane dopo che i partner sono entrato, e può essere una forma di rigetto. Solo all’inizio del XXI secolo, Irving Weissman e Thomas A. Rando alla Stanford University riportarono in vita la parabiosi, per studiare il movimento e il destino delle cellule staminali del sangue.
Parabiosi. Due topi sono cuciti insieme condividendo un flusso sanguigno comune. La parabiosi eterocronica è quando un giovane topo viene unito chirurgicamente a partner anziani,mentre la parabiosi isocronica si riferisce a coppie di animali giovani-giovani o vecchi. Modificato da ref. con il permesso di Nature Publishing Group.
Il gruppo di Stanford ha studiato la rigenerazione muscolare e la proliferazione delle cellule epatiche nell’impostazione della parabiosi. Dopo la lesione muscolare, la rigenerazione muscolare è stata studiata mediante la formazione di miotubi che esprimono la catena pesante della miosina embrionale, un marker specifico di miotubi rigeneranti negli animali adulti. Cinque giorni dopo l’infortunio, i muscoli negli animali giovani in entrambi i parabios isocronici ed eterocronici si erano rigenerati in modo robusto. Al contrario, i muscoli feriti dai vecchi parabionti isocronici si sono rigenerati male. In particolare, la parabiosi con topi giovani ha migliorato significativamente la rigenerazione del muscolo nei vecchi partner. La rigenerazione del muscolo invecchiato era quasi esclusivamente dovuta all’attivazione di cellule progenitrici residenti e invecchiate e non all’attecchimento di cellule progenitrici circolanti da giovani partner (come giudicato dalla presenza di meno dello 0,1% di cellule che esprimono proteine fluorescenti verdi derivate da giovani partner transgenici per GFP). Poiché la perdita di rigenerazione muscolare con l’età è in parte dovuta a una compromissione legata all’età nella regolazione up del Delta del ligando Notch dopo la lesione muscolare , è stata studiata anche l’espressione Delta. In particolare, le cellule satellite dei partner anziani di parabionti eterocronici hanno mostrato una marcata regolazione del Delta, paragonabile a quella trovata nei loro giovani partner e nei giovani topi non sottoposti ad abbinamenti parabiotici (Fig. 2).
Invecchiamento di muscoli, fegato e cervello nei topi anziani e ringiovanimento da parabiosi eterocronica. La rigenerazione del muscolo scheletrico in caso di infortunio è legata alla regolazione del Delta del ligando Notch, che si perde con l’età (pannelli superiori). La proliferazione degli epatociti negli animali giovani è correlata alla diminuzione del complesso cEBP-α-brahma (cEBP-α-Brm) rispetto ai topi invecchiati (pannelli centrali). Mentre gli animali giovani possono aumentare la loro neurogenesi e angiogenesi nella zona subventricolare del cervello, dove sono presenti cellule staminali neurali, gli animali invecchiati non possono (pannelli inferiori). In linea di principio, la parabiosi eteroconica ripristina tutte le caratteristiche fenotipiche e molecolari dell’invecchiamento trasferendo fattori e cellule solubili.
Nel caso di studi sul fegato e come nel muscolo, mentre la proliferazione di cellule positive all’albumina nei vecchi parabionti isoconici era inferiore a quella osservata nei giovani parabionti isocronici, la parabiosi a un partner giovane aumentava significativamente la proliferazione degli epatociti nei topi invecchiati. Come anche nel muscolo, il miglioramento della proliferazione degli epatociti nei topi invecchiati era dovuto alle cellule residenti e non all’attecchimento di cellule circolanti da giovani partner. Il declino della proliferazione delle cellule progenitrici degli epatociti è dovuto alla formazione di un complesso che coinvolge cEBP-α e il fattore di rimodellamento della cromatina brahma (Brm) che inibisce l’espressione genica guidata da E2F . Parallelamente all’effetto sulla rigenerazione degli epatociti, la formazione del complesso CEBP-α-Brm è stata rilevata nei fegati da vecchi parabionti eterocronici ma non da giovani isocronici, e il complesso è stato diminuito nei vecchi parabionti eterocronici (Fig. 2). Infine, nel muscolo e nel fegato, hanno notato una riduzione della proliferazione delle cellule progenitrici nei topi giovani dopo l’associazione parabiotica con topi vecchi, suggerendo che i topi vecchi sono arricchiti con fattori inibitori che vengono diluiti sulla parabiosi. Nel complesso, questi dati hanno indicato che esistono fattori sistemici in grado di modulare le vie di segnalazione molecolare critiche per l’attivazione o l’inibizione delle cellule progenitrici specifiche del tessuto e che l’ambiente sistemico di un animale giovane è quello che promuove la rigenerazione di successo, mentre quello di un animale più anziano non riesce a promuovere o inibisce attivamente la rigenerazione Infine, questo lavoro ha anche dimostrato che le cellule staminali/progenitrici tessuto-specifiche conservano gran parte del loro potenziale proliferativo intrinseco anche quando sono vecchie, ma che i cambiamenti legati all’età nell’ambiente sistemico e/o nella nicchia in cui risiedono le cellule progenitrici, precludono la piena attivazione di queste cellule per la rigenerazione dei tessuti produttivi.
Nel documento del 2010, Wagers e colleghi hanno cercato di capire qual è il ruolo dei fattori locali legati alla nicchia micro ambientale e sistemici nell’invecchiamento delle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC), utilizzando il sistema di topi parabiotici in vivo e studiando la frequenza e il numero di HSC a lungo termine (LT-HSCs). I marcatori congenici sono stati utilizzati per distinguere gli HSC da partner anziani rispetto a quelli giovani. L’invecchiamento è accompagnato a livello del midollo osseo da una notevole espansione degli HSPC accoppiata paradossalmente con una ridotta capacità di ricostituzione del sangue e un potenziale di differenziazione distorto dopo il trapianto . I parabionti eterocronici invecchiati hanno mostrato una significativa riduzione di LT-HSC, che si avvicinava ai normali livelli “giovanili”. In particolare, questo effetto è dovuto ai cambiamenti nella stessa popolazione di HSC invecchiata e non al traffico di cellule “giovani” verso il midollo dei partner anziani. Inoltre, la parabiosi eterocronica ha anche indotto il recupero della funzione LT-HSC nei topi invecchiati, come evidenziato dal potenziale di attecchimento e dal ripristino dei rapporti giovanili tra cellule linfoidi B e mieloidi. Come con HSCs, sia la frequenza che il numero totale di cellule di nicchia osteoblastiche isolabili da topi invecchiati sono aumentati rispetto ai giovani controlli. Esperimenti in vitro di interazione tra giovani cellule del midollo osseo con cellule di nicchia osteoblastiche invecchiate che mostrano anche l’espansione di HSCs, hanno suggerito che gli effetti ringiovanenti di HSC della parabiosi eterocronica si verificano indirettamente-ripristinando i cambiamenti legati all’età nelle cellule di nicchia osteoblastiche. Infatti, la frequenza e il numero degli osteoblasti sono stati ripristinati a livelli giovanili quando gli animali invecchiati hanno sperimentato nella parabiosi eteroconica un giovane ambiente sistemico. Inoltre, le cellule di nicchia isolate da parabiosi eterocronica invecchiata hanno mostrato una capacità significativamente ridotta di causare l’accumulo di HSPC, in contrasto con le cellule di nicchia da parabiosi isocronica invecchiata. È interessante notare che le cellule di nicchia degli osteoblasti isolate dai giovani parabionti eterocronici hanno indotto una leggera espansione degli HSPC giovani rispetto a quelli dei giovani parabionti isocronici. Questi studi in vitro hanno suggerito un effetto reciproco dell’ambiente circolatorio invecchiato sull’attività di nicchia nei giovani partner eterocronici e indicano che i segnali sistemici ripristinano le nicchie invecchiate. Sono stati fatti ulteriori esperimenti, volti a valutare la capacità dei giovani HSPC di ricostituire l’emopoiesi. I risultati hanno dimostrato che, analogamente alla funzione alterata di attecchimento degli HSC invecchiati naturalmente , i giovani HSPC esposti in vitro a cellule nickel isocroniche invecchiate mostravano una ridotta capacità di ricostituzione ematopoietica. Ciò indica che l’interazione con le cellule di nicchia osteoblastiche invecchiate è sufficiente per indurre difetti nella funzione HSC. Tuttavia, le cellule di nicchia eterocroniche invecchiate non hanno alterato l’attività ricostituente dei giovani HSC. Insieme, questi dati hanno dimostrato che le alterazioni funzionali indotte dall’età nelle cellule di nicchia regolatrici di HSC possono essere invertite da fattori circolanti giovani. Nel complesso, questi risultati suggeriscono ulteriormente che gli effetti ringiovanenti di una giovane circolazione su HSC sono comunicati indirettamente – segnalando da cellule di nicchia osteoblastiche ringiovanite.
Per capire quale fattore è coinvolto nella regolazione della funzione cellulare di nicchia, gli autori hanno cercato di indagare se il fattore di crescita insulino-simile-1 (IGF-1) potrebbe svolgere un ruolo. IGF-1 è stato indicato per essere un regolatore evolutivamente conservato di longevità e di invecchiamento . Esperimenti in vitro e in vivo hanno dimostrato che l’IGF-1 locale, non sistemico, sembra indurre l’invecchiamento delle cellule di nicchia regolatrici di HSC e che la neutralizzazione della segnalazione di IGF-1 nel microambiente del midollo osseo ripristina i cambiamenti legati all’età nelle cellule di nicchia osteoblastiche che compromettono la loro appropriata regolazione degli HSC.
Nel complesso, questi risultati hanno suggerito che mentre in condizioni giovanili le cellule di nicchia osteoblastiche promuovono il mantenimento omeostatico delle cellule staminali, sono alterate dall’invecchiamento in modo tale da consentire invece l’accumulo maggiore di HSC disfunzionali. Queste alterazioni specifiche dell’età nelle cellule di nicchia sembrano essere segnalate da fattori circolanti non caratteristici che agiscono in parte alterando la segnalazione di IGF-1 nella cellula di nicchia stessa (Fig. 3). È probabile che IGF-1 non abbia un ruolo importante per tutto il tessuto invecchiato, poiché mentre il suo ruolo nella nicchia osteoblastica sta promuovendo l’età, al contrario nell’espressione locale del muscolo scheletrico di IGF-1 mantiene la capacità rigenerativa in animali invecchiati.
Modello proposto che descrive i cambiamenti legati all’età nella nicchia cellulare osteoblastica e HSCs, e come questi cambiamenti possono essere invertiti da parabiosi eterocronica. I cambiamenti specifici per età negli effetti autocrini o paracrini di IGF-1 sulle cellule di nicchia osteoblastiche sono segnalati da fattori solubili circolanti che a loro volta cambiano con l’età. IGF-1 segnalazione in età osteoblastica cellule di nicchia (a) contribuisce direttamente alla disfunzione legata all’età in HSCs, tra cui HSC over-accumulo e distorta B linfoide (cellula B)/mieloide (Mio) scelta destino. A seguito di parabiosi eterocronica, o dopo la neutralizzazione della segnalazione di IGF-1 in vivo (b), l’attività “giovanile” delle cellule di nicchia invecchiate viene ripristinata, in modo tale da non indurre più l’accumulo eccessivo o l’inclinazione del lignaggio di HSC. Da ref. con il permesso di Nature Publishing Group.
Nell’ottobre 2010, tre dei quattro autori, tra cui Amy J. Scommesse, retratto questo documento, in particolare per il ruolo delle cellule di nicchia osteoblastiche nel ringiovanimento di HSCs in topi invecchiati . È stato scoperto che il primo autore ha manipolato le immagini per i noduli ossei formati in cellule di nicchia osteoblastiche da topi giovani e anziani (Retraction Watch, http://retractionwatch.com/2012/08/29/ori-finds-harvard-stem-cell-lab-post-doc-mayack-manipulated-images/). Pertanto, si dovrebbe ottenere un’ulteriore conferma sul suo problema, considerando anche che il modello di parabiosi è stato sfruttato per studiare il ringiovanimento di altri vecchi organi. In effetti, due documenti sono apparsi successivamente dimostrando che l’esposizione di un topo giovane a un vecchio ambiente sistemico può inibire la miogenesi e la neurogenesi .
Nel 2013, il team guidato da Amy J. Wagers, ha pubblicato un altro lavoro con cui ha dimostrato utilizzando il modello parabiosi, che l’ipertrofia cardiaca correlata all’età può essere invertita dall’esposizione a un giovane ambiente circolatorio con solo 4 settimane di parabiosi . La misurazione della pressione arteriosa e dei livelli circolanti di angiotensina II e aldosterone nei vari gruppi, ha chiaramente dimostrato che l’inversione dell’ipertrofia cardiaca nei topi anziani esposti a una circolazione giovane non poteva essere spiegata da una semplice riduzione della pressione arteriosa o dalla modulazione di effettori noti della pressione arteriosa nei topi anziani. È interessante notare che la parabiosi eterocronica non ha indotto cambiamenti nel rapporto peso-tibia del cuore, nella dimensione dei cardiomiociti o nella pressione sanguigna nei topi giovani uniti a partner anziani. Questi dati implicavano un fattore antiipertrofico prodotto da topi giovani (piuttosto che la diluizione di un fattore proipertrofia prodotto da topi vecchi) nel rimodellamento cardiaco indotto dalla parabiosi eterocronica. Nella “parabiosi fittizia”, in cui i topi vengono uniti chirurgicamente lasciando la pelle intatta, in modo tale da non sviluppare una circolazione condivisa, non è stata trovata alcuna differenza significativa nel rapporto peso-tibia del cuore nei topi anziani, indicando inoltre che sono necessari fattori di circolazione incrociata e scambio di sangue per l’inversione dell’ipertrofia cardiaca correlata all’età. Al fine di identificare questi fattori, un’analisi di proteomica su larga scala utilizzando la tecnologia basata su aptamer ha rivelato 13 analiti che distinguevano in modo affidabile i topi giovani dai topi vecchi. Uno di questi candidati, il fattore di differenziazione della crescita 11 (GDF11), un membro della superfamiglia activin/TGF-β, è stato confermato in ulteriori analisi. GDF11 è stato ridotto nel plasma di vecchi topi isocronici rispetto ai giovani topi isocronici ed è stato ripristinato a livelli giovanili nei topi vecchi dopo l’esposizione a una circolazione giovane. Un trattamento giornaliero di 30 giorni di vecchi topi con GDF11 ha portato a una significativa riduzione del rapporto peso-lunghezza cuore-tibia rispetto al gruppo di controllo iniettato con soluzione salina. Questi dati hanno suggerito che almeno una componente patologica dell’insufficienza cardiaca diastolica correlata all’età è di natura ormonale. Tuttavia, la regressione osservata dell’ipertrofia cardiaca nei topi vecchi esposti a una circolazione giovane è improbabile che sia attribuibile interamente al reintegro di un singolo fattore e altri fattori dovrebbero essere riconosciuti.
Due studi successivi di Wagers e colleghi hanno scoperto che GDF11 ha potenziato la crescita di nuovi vasi sanguigni e neuroni nel cervello e stimolato le cellule staminali per rigenerare il muscolo scheletrico nei siti di lesioni . In uno di questi documenti , il modello di parabiosi eterocronica del topo ha rivelato un aumento del volume dei vasi sanguigni cerebrali e del flusso sanguigno in risposta a fattori sistemici giovani, insieme a un maggiore auto-rinnovamento e differenziazione nella popolazione di cellule staminali neurali della zona subventricolare, portando un miglioramento nella discriminazione olfattiva (Fig. 2). Inoltre, hanno scoperto che GDF11 potrebbe aumentare il volume dei vasi sanguigni e la neurogenesi nei topi vecchi. È interessante notare che il sangue di topi di 15 mesi non ha ridotto le popolazioni di cellule staminali neurali nel cervello giovane, mentre il sangue più vecchio (21 mesi) ha provocato un effetto dannoso, suggerendo che gli animali più anziani aumentano l’accumulo di fattori sistemici deleteri e/o fattori giovani protettivi inferiori. D’altra parte, nel documento scritto da Rando e Tony Wyss-Corey come scienziati senior, la chemochina CCL11/eotaxina è stata identificata come un fattore ematico correlato all’età associato a diminuzione della neurogenesi e compromissione dell’apprendimento e della memoria nei topi . Ciò che deve essere determinato è se CCL11 interagisce direttamente con le cellule progenitrici neurali durante l’invecchiamento influenzando la loro capacità di differenziazione, o ha azioni indirette da interazioni con altri tipi di cellule di nicchia neurogena.
Nell’altro documento di Wagers e colleghi , è stato dimostrato che le cellule satellite ordinate da topi eterocronici invecchiati avevano migliorato la capacità di differenziazione miogenica e un danno al DNA inferiore rispetto alle cellule satellite dei controlli isocronici invecchiati. Per quanto riguarda la reversione dell’ipertrofia cardiaca correlata all’età , il trattamento di topi invecchiati con iniezioni intraperitoneali giornaliere di GDF11 ricombinante per 4 settimane ha aumentato il numero di cellule satellite con DNA intatto, rispetto alle cellule di topi invecchiati che ricevono il veicolo da solo. Inoltre, in un modello di lesione muscolare, il trattamento GDF11 di topi invecchiati 28 giorni prima dell’infortunio e continuato per 7 giorni dopo ha ripristinato i profili più giovanili del calibro di miofibra nella rigenerazione muscolare. Anche i topi invecchiati trattati con GDF11 hanno mostrato un aumento della resistenza media all’esercizio e della forza di presa.
In questo ultimo articolo, hanno anche scoperto che l’esposizione in vitro di cellule satellite invecchiate a GDF11, ma non alla miostatina (un altro membro della superfamiglia TGF-β) o TGF-β1, ha prodotto aumenti dose-reattivi nella proliferazione e differenziazione delle cellule satellite, suggerendo che GDF11, a differenza della miostatina, può agire direttamente sulle cellule satellite per alterare la loro funzione.