TESTO

Le infezioni del tratto respiratorio inferiore sono la principale causa di ospedalizzazione correlata alle malattie infettive negli Stati Uniti (13). Abbiamo precedentemente determinato la frequenza di infezioni virali specifiche associate a condizioni del tratto respiratorio acuto che portano a ricoveri ospedalieri (5). I pazienti arruolati nello studio sono stati ricoverati in un ospedale pubblico o privato e le infezioni da virus respiratorio sono state identificate mediante colture cellulari e studi sierologici. Poiché il numero di infezioni da virus respiratorio associato con malattie respiratorie può essere aumentata mediante l’applicazione di trascrizione inversa-PCR (RT-PCR) test (3, 6), abbiamo applicato queste analisi di campioni raccolti e messi da parte per questo scopo nel corso di un periodo di 2 anni per determinare se ulteriori infezioni da virus respiratorio possono essere identificati in questa coorte.

I dettagli dello studio clinico sono stati descritti in precedenza (5). In breve, i partecipanti allo studio erano persone di tutte le età che sono state ricoverate al Ben Taub General Hospital o al St. Luke’s Episcopal Hospital di Houston, TX, con una condizione respiratoria acuta (polmonite, tracheobronchite, bronchiolite, groppa, esacerbazioni di asma o broncopneumopatia cronica ostruttiva o insufficienza cardiaca congestizia). I campioni respiratori (lavaggio nasale o tampone per la gola) e i campioni di siero sono stati raccolti entro una mediana di 1 giorno di ospedalizzazione. Questo substudy è stato condotto su partecipanti arruolati dal 1 ° settembre 1993 alla fine dello studio nel maggio 1995. Il campione respiratorio è stato miscelato con brodo di infusione di vitello come stabilizzante al momento della raccolta, trasportato in laboratorio su ghiaccio umido e inoculato sulla coltura cellulare. Il campione rimanente è stato aliquotato e congelato a < -70°C fino a quando non è stato testato utilizzando saggi molecolari (descritti di seguito). In generale, i campioni sono stati sottoposti a uno o due congelamenti per generare cDNA per i test iniziali. Un campione di siero in fase di convalescenza è stato ottenuto 14-42 giorni dopo. Tutti i soggetti hanno fornito il consenso informato in base a un protocollo approvato dal Baylor College of Medicine Institutional Review Board.

I metodi utilizzati per la coltura cellulare e la sierologia sono stati descritti in precedenza (5). I test di coltura cellulare sono stati testati per virus influenzali di tipo A e B, virus parainfluenzale (PIV) tipi da 1 a 3, virus respiratorio sinciziale (RSV), rinovirus, enterovirus, herpesvirus e adenovirus. Le analisi sierologiche sono state eseguite come descritto in precedenza (5) su campioni di siero accoppiati per virus influenzali A e B, PIV tipi da 1 a 3, RSV e coronavirus 229E e OC43.

I test RT-PCR sono stati eseguiti utilizzando test RT-PCR in tempo reale precedentemente descritti per i virus dell’influenza A e B e coronavirus OC43 e 229E (3). I tipi di PIV da 1 a 3 (PIV1, PIV2 e PIV3, rispettivamente), RSV, metapneumovirus umano (HMPV) e infezioni da picornavirus sono stati identificati utilizzando test RT-PCR precedentemente descritti seguiti da ibridazione Southern blot (3). I campioni positivi al picornavirus sono stati ulteriormente classificati utilizzando saggi RT-PCR in tempo reale specifici per rhinovirus e enterovirus quando rimaneva un campione sufficiente per questi saggi (8, 11).

Un totale di 403 malattie separate si è verificato durante il periodo di studio di 2 anni in 364 persone. Settantasei virus respiratori (escluso il virus dell’herpes simplex e il citomegalovirus ) sono stati isolati da 75 campioni di malattia raccolti durante il periodo di studio. Questi includevano 26 picornavirus, 21 RSV, 19 virus influenzali, 4 adenovirus e 2 ciascuno di PIV1, PIV2 e PIV3 (Tabella 1). Trenta malattie (su 136 sieri accoppiati testati) hanno avuto anche 33 infezioni identificate dalla sierologia , 11 delle quali sono state identificate dalla cultura (6 influenza A sottotipo H3N2, 4 RSV e 1 influenza B). Ulteriori infezioni sierologiche, ma non dalla cultura inclusi sette A/H3N2, di cui tre di RSV, PIV2, PIV3, e OC43, e uno ciascuno A/H1N1, PIV1, e 229E.

Campioni respiratori da 386 malattie (95.8%) erano disponibili per test molecolari. Centosettantadue campioni (44,6%) sono risultati positivi per almeno uno dei virus analizzati (Tabella 1), con un picornavirus (n = 99) che è l’infezione più comune identificata. Tutti i virus per i quali sono stati eseguiti i test RT-PCR sono stati rilevati tranne PIV2; nessuna infezione PIV2 è stata identificata da RT-PCR, mentre due infezioni sono state trovate utilizzando colture cellulari. Complessivamente, 200 (49,6%) delle 403 malattie erano associate ad almeno un’infezione da virus. Più di un’infezione da virus è stata identificata in 33 malattie (31 con due infezioni e 2 con tre infezioni). Ventidue delle infezioni multiple includevano un picornavirus, con un picornavirus e RSV come combinazione più comune (n = 10); la doppia infezione da RSV e virus dell’influenza A è stata rilevata in 3 malattie. Un altro virus respiratorio è stato identificato in tutte e tre le malattie da cui è stato isolato il CMV e in 6 delle 11 malattie da cui è stato isolato l’HSV.

Un’infezione virale è stata identificata nel 77,6% dei bambini di età inferiore ai 5 anni (Tabella 2). I bambini più grandi avevano un’infezione identificata in più del 50% delle loro malattie e gli adulti avevano un’infezione identificata in circa un terzo delle loro malattie. Le infezioni multiple sono state identificate più frequentemente nei bambini di età inferiore a 1 anno.

L’applicazione di metodi molecolari per la diagnosi di infezione virale respiratoria è aumentata la frequenza con cui l’infezione da virus respiratorio è identificato in pazienti con riacutizzazioni di asma (1, 6), malattia polmonare ostruttiva cronica (3, 12), e bronchiolite (4, 10) e nei campioni sottoposti generale virali respiratorie studi diagnostici (2, 9). In precedenza abbiamo eseguito uno studio epidemiologico che esamina l’impatto dell’infezione da virus respiratorio su una coorte di comunità utilizzando metodi diagnostici virali tradizionali (cultura e sierologia). Applicazione di RT-PCR analisi di campioni raccolti in questo studio, è aumentato il numero di infezioni virali identificati da circa 2 volte a causa della maggiore sensibilità del test per alcuni virus (ad esempio, picornavirus) rispetto a quella di una cella cultura e per la possibilità di identificare altri virus che sono scarsamente o non coltivabili (ad esempio, HMPV e coronavirus).

La famiglia di virus con la maggiore frequenza di rilevamento era picornavirus (specie enterovirus e rinovirus), essendo identificata in circa il 25% degli episodi di malattia. Poiché i primer specifici per rhinovirus e enterovirus utilizzati non sono stati convalidati contro tutte le specie di rhinovirus e enterovirus, è possibile che siano state perse ulteriori infezioni da picornavirus non rilevate. La maggiore identificazione delle infezioni da picornavirus mediante analisi molecolari è in linea con i risultati di altri studi su bambini di età inferiore ai 5 anni e pazienti con asma, BPCO e bronchiolite (1, 6, 7, 10, 12).

In sintesi, l’uso di test diagnostici molecolari ha aumentato la frequenza di identificazione di un’infezione virale respiratoria in persone ricoverate in ospedali per acuti con una condizione respiratoria acuta. In questa coorte, oltre il 75% delle malattie respiratorie nei bambini di età inferiore ai 5 anni è stato associato alla rilevazione di un virus respiratorio, rispetto al 25-37% delle malattie negli adulti. La prevalenza delle infezioni virali respiratorie può essere stata ancora più alta poiché non abbiamo analizzato i coronavirus NL63 o HKU1 o il tipo 4 di PIV. Le infezioni da picornavirus (principalmente rhinovirus) sono state le infezioni più comuni identificate in pazienti di tutte le età, seguite da quelle causate da RSV e dai virus influenzali. L’uso di saggi molecolari aumenta la frequenza di identificazione di un’infezione virale respiratoria rispetto a quella dei classici metodi diagnostici virali di coltura cellulare e sierologia.