LETTERA

Neisseria meningitidis può causare malattie sistemiche potenzialmente fatali. La diagnosi precoce e il pronto intervento antimicrobico sono fondamentali per risultati clinici favorevoli. È stata riportata resistenza agli antibiotici per penicilline (1), tetracicline (2) e sulfonamidi (3), così come chinoloni (4) e rifampicina (5).

N. meningitidis esprime due porine principali, PorA e PorB, che sono antigenicamente variabili tra ceppi e all’interno di un ceppo, e PorA è variabile di fase (commutazione casuale on/off) (6). Neisseria gonorrhoeae esprime un singolo porino, PorB. I cambiamenti nell’espressione della porina o nella variante porina mediano la resistenza agli antibiotici in diversi batteri Gram-negativi, tra cui N. gonorrhoeae (7,-10). In N. meningitidis, l’assenza di PorB aumenta la resistenza alla tetraciclina e alla cefsulodina in vitro (11). Il ruolo di PorA nella resistenza antimicrobica non è stato riportato per il meningococco. Oltre al suo ruolo proposto nell’evasione immunitaria, abbiamo ipotizzato che l’espressione PORA variabile di fase possa fornire un meccanismo ovvio per il meningococco per eludere gli antimicrobici se PorA media l’assorbimento o l’esclusione di antibiotici. Abbiamo generato ceppi privi di PorA o PorB e condotto test MIC. Abbiamo anche testato se l’espressione alterata di PorA è selezionata dall’esposizione antimicrobica durante il corso del test MIC.

I geni porA e porB con sequenze di accompagnamento sono stati amplificati dal ceppo N. meningitidis MC58 e clonati in pGEM T-easy. La PCR inversa seguita dall’auto-legatura ha prodotto plasmidi con delezioni interne e ha introdotto siti di restrizione. La cassetta LacZ / kanamicina (12) è stata clonata nel sito SMAI introdotto dell’allele Pora eliminato, producendo plasmide pPorALacZKan. Un gene cloramfenicolo acetiltransferasi è stato amplificato e clonato nel sito BglII introdotto dell’allele PORB eliminato, nel plasmide pPorB: CAT. I costrutti porA lacZ kan o porB:: cat sono stati trasformati in ceppo N. meningitidis ¢9 (13) per produrre ceppi ¢9ΔPorA e ¢9ΔPorB. La sostituzione allelica degli alleli PORA o porB wild-type con l’allele mutante è stata confermata dalla PCR e dal sequenziamento, nonché dalla SDS-PAGE delle proteine della membrana esterna estratte da Sarkosyl (Fig. 1 BIS).

Analisi dell’espressione di porin durante l’analisi MIC. (A) Le proteine di membrana sono state isolate mediante estrazione di Sarkosyl e 10 µg sono stati separati su gel di acrilammide bis-Tris all ‘ 8-12% prima della colorazione di Coomassie. Corsia 1, ¢9; corsia 2, ¢9ΔPorA; corsia 3, ¢9ΔPorB. (B) I campioni dell’ultimo pozzo che mostra torbidità sono stati placcati su BHI agar e immunoblotted con il PORA-specifico MAb MN14C11.6.

I MIC sono stati valutati con il metodo della microdiluzione del brodo in piastre a 96 pozzetti (14) utilizzando batteri coltivati durante la notte su agar BHI integrato a 37°C e agitazione sottoculturata per circa 4 h in brodo BHI a 37°C prima di adattarsi a circa 5 × 105 CFU / ml in base alla densità ottica a 600 nm (OD600). Dopo l’aggiunta di 50 µl ad antibiotici diluiti in serie, le MIC sono state registrate dopo una crescita notturna a 37 ° C (Tabella 1) come concentrazioni alle quali non è stata osservata torbidità. Ogni saggio è stato fatto tre volte, ogni volta in triplice copia. Per ogni trattamento, i MICROFONI erano identici all’interno e tra le analisi.

I nostri risultati hanno confermato che la perdita di espressione del PorB meningococcico aumenta la resistenza alla tetraciclina (11). Mutazioni in PorB contribuiscono anche alla resistenza alla tetraciclina in N. gonorrhoeae (9, 15). La terapia di associazione raccomandata per N. gonorrhoeae resistente alle moltiplicazioni comprende ceftriaxone iniettabile e doxiciclina orale o azitromicina (16). In questo contesto, è notevole che il ceppo mutante meningococcico ¢9ΔPorB aveva ridotto la suscettibilità alla doxiciclina. Abbiamo notato una diminuzione della suscettibilità alla cefalotina per ¢9ΔPorB e anche per le cefalosporine cefotaxime e ceftazidima. Un precedente rapporto collegava la mutazione di N. meningitidis PorB con una maggiore resistenza alla cefsulodina (11). In N. gonorrhoeae, PORB loop 3 varianti contribuiscono anche ad una maggiore resistenza alle cefalosporine (17). La nostra conferma che Neisseria PorB modula la suscettibilità alle cefalosporine aumenta la possibilità che la riduzione della suscettibilità a questa classe possa insorgere clinicamente o essere facilitata da mutazioni in PorB in meningococchi o gonococchi.

L’uso di fluorochinoloni non è più raccomandato per l’infezione gonococcica (18) e le mutazioni puntiformi in PorB1b di N. gonorrhoeae contribuiscono alla ridotta suscettibilità di N. gonorrhoeae alla ciprofloxacina. I cambiamenti di espressione nella porina gonococcica alterano la resistenza alla ciprofloxacina (19); abbiamo scoperto che la mutazione del PorB meningococcico provoca anche una ridotta suscettibilità alla ciprofloxacina. Al contrario, questo ceppo era più suscettibile alla rifampicina, l’altra scelta principale per la profilassi meningococcica, forse attraverso un’architettura di membrana alterata, come è stato suggerito per l’alterata resistenza alla rifamicina dell’Acinetobacter baumannii resistente alla colistina (20).

Al contrario, non abbiamo osservato cambiamenti nella suscettibilità di ¢9ΔPorA rispetto al ceppo progenitore di PorA+ per nessuno degli antibiotici testati (Tabella 1). Ciò suggerisce che il PorA non ha alcun ruolo diretto nell’ingresso di antimicrobici nella cellula o che vi è una selezione per una ridotta espressione di PorA tramite variazione di fase durante il test MIC, sia nel ceppo parentale o in ¢9ΔPorB, potenzialmente mascherando l’ingresso antibiotico mediato da PorA. Per valutare questo, abbiamo isolato i batteri dal pozzo finale in cui è stata osservata la torbidità e valutato l’espressione di PorA mediante immunoblotting delle colonie utilizzando l’anticorpo monoclonale murino anti-P1.7 (MAB) MN14C11.6 (ottenuto da NIBSC, Regno Unito). Come controlli, la reattività è stata confrontata tra il ceppo parentale ¢9 e il ceppo mutante Pora ¢9ΔPorA. Ciò ha dimostrato che l’espressione di PorA era inalterata tra i pozzetti di controllo e dopo l’esposizione a uno qualsiasi degli antimicrobici testati (vedi Fig. 1B); pertanto, la ridotta suscettibilità di ¢9ΔPorB non è dovuta a livelli di espressione di PorA alterati.

I nostri risultati sono coerenti con precedenti rapporti per un ruolo per N. meningitidis PorB nelle cefalosporine e nella resistenza alle tetracicline (9, 11, 15). I paralleli con PorB1b gonococcico rispetto alla resistenza agli antibiotici sono sorprendenti. L’eliminazione dell’espressione di PorB ha anche ridotto la suscettibilità meningococcica alla doxiciclina, una delle terapie raccomandate per le N. gonorrhoeae resistenti alla moltiplicazione. In modo problematico, ciò suggerisce che la pressione selettiva può portare alla comparsa di varianti di PORB gonococcico con ridotta suscettibilità alla doxiciclina. Sebbene abbiamo registrato solo differenze di 2 volte che sono improbabili in isolamento per portare a fallimenti del trattamento, la sinergia della variazione di PorB con altre mutazioni ha il potenziale per espandere lo spettro di resistenza meningococcica e gonococcica. Non abbiamo trovato prove di un ruolo per PorA nel transito antimicrobico attraverso la membrana esterna.