Come accennato in precedenza, la composizione degli RNA casuali è stata scelta per corrispondere, in media, a quella degli RNA virali il più vicino possibile. Tuttavia, molti singoli RNA virali differiscono significativamente nella composizione dagli RNA casuali, sollevando la questione se le stesse differenze in M MLD would sarebbero viste se gli RNA virali fossero ciascuno confrontati con RNA casuali di composizione identica. Per testare la sensibilità alla composizione dei valori M MLD of degli RNA casuali, abbiamo analizzato 3.000-base di RNA permutati casualmente di composizione uniforme (25% G, 25% C, 25% A, 25% U). I risultati, elencati nella Tabella 2, mostrano che M MLD is è insensibile a piccole modifiche di composizione. Inoltre, la composizione media degli RNA di lievito differisce significativamente da quella di entrambi gli insiemi di RNA casuali, tuttavia i loro valori M MLD are sono approssimativamente gli stessi.

Quanto è probabile che le differenze previste in M MLD between tra RNA virali e non virali siano presenti negli RNA effettivi? RNAsubopt e tutti i programmi simili che prevedono la struttura dell’RNA hanno la capacità, in linea di principio, di trovare tutte le possibili strutture non pseudoknotted. Pertanto, l’accuratezza di RNAsubopt (la sua capacità di campionare correttamente dall’insieme) non dipende da quali strutture è in grado di prevedere (può prevederle tutte, escludendo quelle con pseudoknots), ma piuttosto dalle energie che assegna loro, che sono determinate dal suo modello energetico. Come accennato in precedenza, richiediamo solo che RNAsubopt sia sufficientemente preciso per prevedere le caratteristiche generali a grana grossa della struttura secondaria dell’RNA, come M MLD〉. Per valutare se i nostri risultati sono specifici per RNAsubopt (e quindi forse un artefatto del particolare modello energetico su cui si basa RNAsubopt), abbiamo confrontato gli SSRNA virali e casuali usando mpold, che è simile a RNAsubopt ma differisce in qualche modo sia nel suo modello energetico che nelle strutture che campiona dall’insieme. Mentre i valori M MLD generated generati da RNAsubopt sono diversi dai valori AMLD generati da mpold, entrambi hanno mostrato la stessa differenza sistematica in MLD tra SSRNA virali e casuali e approssimativamente le stesse relazioni di scala per le sequenze casuali (AMLD N N0. 74±0.01 per mpold, vedere Fig. S4).

Per testare ulteriormente la robustezza di queste previsioni, abbiamo confrontato gli SSRNA casuali e virali usando il nostro programma di piegatura dell’RNA semplificato. Questo programma non determina singole strutture secondarie e di conseguenza non consente il calcolo di M MLD〉. Tuttavia, determina le probabilità di accoppiamento, che consente il calcolo della distanza media massima della scala (MALD) dell’intero insieme di strutture, che è il valore massimo delle medie dell’insieme delle distanze di scala N2 associate a ciascuna sequenza N-base. Troviamo che questo programma—come quelli discussi sopra, che si basano su assegnazioni energetiche più realistiche-prevede anche differenze sistematiche tra RNA casuali e virali, dando valori MALD più piccoli per le sequenze virali rispetto a quelli non virali (vedi Fig. S5). Pertanto, anche un modello energetico altamente semplificato che tiene semplicemente conto delle interazioni più vicine è sufficiente per rivelare una differenza fondamentale tra le strutture secondarie delle sequenze di ssRNA virali e permutate casualmente. Con questo modello semplificato, per sequenze casuali di lunghezze 2,000-4,000, MALD N N0. 66±0.02.

I programmi di piegatura che impieghiamo non possono produrre strutture che contengono pseudoknots. Sebbene pseudoknots siano noti per verificarsi in RNA virali, come quelli che formano strutture simili a tRNA 3′-terminale (8), sono tipicamente locali (coinvolgendo basi separate da <102 nt lungo la sequenza); di conseguenza, ignorarli non dovrebbe influenzare significativamente la nostra previsione della dimensione complessiva. Sono state trovate prove per pseudoknots a più lungo raggio, come baciare forcine che collegano basi separate da ben 400 nt (31), ma anche queste sono vicine alla lunghezza complessiva dei genomi virali. In ogni caso, il nostro obiettivo è quello di sviluppare un modello teorico di ordine zeroth che cattura i determinanti della dimensione complessiva, con pseudoknots, kissing hairpins e altri dettagli inclusi in seguito, se necessario.

Per tradurre M MLD into in Rg, è utile mappare le strutture secondarie dell’RNA su modelli polimerici le cui statistiche configurazionali sono ben comprese, come i polimeri lineari ideali e “stellari”. Usando l’idealizzazione più semplice, come nel modello a catena liberamente snodato discusso sopra, possiamo sostituire strutture come le due mostrate in Fig. 1 A e B da catene lineari le cui lunghezze di contorno effettive (Leff) sono date dai loro valori M MLD.. Per completare questa mappatura, modelliamo le sezioni duplex come i collegamenti rigidi della catena e i rigonfiamenti ss, bolle e anelli multibranchi come i giunti flessibili che li collegano. La lunghezza effettiva di Kuhn (beff) è quindi la lunghezza media duplex nella struttura secondaria ssRNA, una proprietà che è approssimativamente la stessa (5 bp) per tutte le sequenze esaminate. Ciò corrisponde ad una lunghezza media duplex di RNA di 1-2 nm. Poiché la lunghezza di persistenza (una misura della scala di lunghezza in cui si osserva la flessione) di dsRNA è ≈60 nm (32), modellare le sezioni duplex come corpi rigidi è un’ottima approssimazione. I loop ss, in media, contengono circa sei basi ss, e quindi stimiamo che una tipica bolla abbia circa tre basi ss su ciascun lato; la lunghezza di persistenza di ssRNA è probabilmente simile a quella di ssDNA, circa due basi (33).

Da questa associazione tra strutture secondarie ed efficace polimeri lineari, ne consegue che la Rg di un ssRNA molecola con una sequenza arbitraria deve essere determinata da un Combinando l’ultima equazione con i nostri precedenti risultati, 〈MLD〉 ∼ N0.67, i rendimenti Per un non-self-evitando catena lineare, ν = 0.5, nel qual caso, Rg ∼ N0.34; per evitare catena lineare, n ≈ 0.6, dando Rg ∼ N0.40.

Questo approccio può essere ampliato mappando le strutture secondarie ssRNA su un sistema modello polimerico alternativo che rappresenta tutti i possibili percorsi attraverso la struttura e quindi include tutti i rami. Per qualsiasi polimero ideale, lineare o ramificato, dove Lij è la distanza lungo la spina dorsale tra i monomeri i e j (34). Procedendo come sopra, otteniamo dove Lij, eff è stato sostituito da LDij nel secondo passaggio. L’ALD è la distanza media della scala, cioè, la media delle distanze di scala a coppie N2 in una struttura secondaria di RNA, e 〈ALD is è la sua media di insieme. Utilizzando i valori per 〈ALD calculated calcolati esattamente dalle probabilità di accoppiamento generate da RNAfold, abbiamo ripetuto l’analisi mostrata in Fig. 2. I risultati sono equivalenti, con ss ALD N N0.68±0.01 e Rg N N0.34, e dimostrano che le differenze tra SSRNA casuali e virali sono preservate quando i rami sono esplicitamente inclusi (vedi Fig. 3 e i punteggi Z dei valori AL ALD in nell’ultima colonna della Tabella 1). Come con MLD, ALD è robusto rispetto al modello energetico. I risultati ottenuti con il programma di piegatura semplificato (AL ALD N N0.68±0.01) sono mostrati in Fig. S6.