Che cosa sono le proteine dello scaffold?

Gli scaffold proteici sono membri della cascata di segnalazione a valle dei recettori della superficie cellulare. Le proteine dello scaffold aiutano a trasmettere il messaggio tra la membrana cellulare e il nucleo più velocemente. Lo fanno fungendo da sito di attracco per più partner proteici nella cascata in modo che possano essere vicini l’uno all’altro. Questa vicinanza riduce il tempo necessario per una proteina nella cascata per trovare il suo partner. Alcuni scaffold proteici rimangono scaricati fino a quando un messaggio da un recettore di membrana attivato li raggiunge, dopo di che vengono ancorati da diverse proteine nella cascata. Altri scaffold proteici sono ancorati dalle proteine nella cascata anche prima che un recettore di membrana attivato invii loro un messaggio, aumentando l’efficienza in cui il messaggio viene trasmesso dal recettore al nucleo.

GPCRs e Scaffold Proteins

I recettori accoppiati alle proteine G (GPCRs) sono una grande classe di proteine di superficie cellulare che trasmettono segnali extracellulari al nucleo. Un esempio di un GPCR è il recettore β-adrenergico che percepisce l’adrenalina ormonale. Una volta attivato da un ligando sulla superficie cellulare esterna, i GPCR attivano le loro G-proteine affini che risiedono sulla membrana cellulare interna. Le G-proteine attivate quindi scivolano lungo l’interno della membrana cellulare per attivare una cascata di proteine ed enzimi che a loro volta amplificano il messaggio originale ricevuto dal GPCR. Le proteine dello scaffold sono hub chiave di informazioni a valle dei GPCR attivati. Le proteine dell’impalcatura reclutano i membri a valle di una cascata di segnalazione alla membrana cellulare interna molto rapidamente, o in anticipo, rendente lo efficiente affinchè il messaggio si muova da GPCR a cytosol.

Stati di Attivazione della Cascata di Segnalazione

La complessità di segnalazione intracellulare è che le proteine in una cascata di segnalazione hanno diversi stati di attività (cioè off, parzialmente attivo, completamente attivo). Questi stati dipendono dai cambiamenti conformazionali che derivano dalle interazioni con altre proteine. Dipendono anche dalla presenza o dall’assenza di parti, come gruppi fosfatici, gruppi di ubiquitina e ioni di calcio. Lo stato di attivazione di una proteina di segnalazione è spesso usato come indicatore di se un determinato percorso è stato attivato. Ad esempio, MEK o ERK fosforilato è spesso interpretato come rappresentante dell’attivazione di una via di segnalazione intracellulare a valle di un GPCR. Inoltre, queste proteine di segnalazione possono avere più siti di fosforilazione, diverse combinazioni delle quali influenzano il livello di attività o emivita della proteina. Proteine come MEK ed ERK sono noti per legarsi l’uno vicino all’altro sulle proteine dello scaffold. La capacità delle proteine dello scaffold di legare MEK ed ERK è regolata anche in termini di stato di attivazione dello scaffold, che cambia dopo la modifica post-traslazionale mediante aggiunta di parti chimiche.

Scegliere gli epitopi giusti per informazioni accurate

La suddetta complessità della segnalazione intracellulare è precisamente il motivo per cui scegliere gli anticorpi giusti è cruciale quando i ricercatori cercano di determinare con precisione lo stato di una cellula in risposta a stimoli extracellulari. Ogni conformazione attiva di una proteina o di un sito di fosforilazione può servire come un epitopo diverso che può essere legato da un anticorpo. Pertanto, gli anticorpi progettati per rilevare la presenza o l’assenza di una frazione chimica su una proteina di segnalazione possono dare ai ricercatori un quadro chiaro di quale percorso è stato attivato e in che misura. Gli epitopi fosforilati sono spesso obiettivi di immunoblotting e saggi di immunolocalizzazione in situ. Poiché una proteina può avere più siti di fosforilazione, ognuno dei quali influenza la proteina in modo diverso, oltre a più siti per parti come l’ubiquitinazione, scegliere gli epitopi giusti da rilevare è un compito fruttuoso, ma non banale.

Epitopi multipli, sia sulla stessa proteina che su proteine diverse, possono essere rilevati simultaneamente o sequenzialmente sulla stessa macchia o sulle stesse cellule. È quindi importante che le specie ospiti giuste per gli anticorpi primari e secondari siano considerate con accortezza. Gli anticorpi a dominio singolo sono anche utili per questi esperimenti, che aggiungono alla versatilità delle combinazioni di anticorpi che possono essere utilizzati nello stesso test.

Sia gli anticorpi monoclonali che policlonali sono utili per rilevare lo stato delle cascate di segnalazione intracellulare. La nostra guida alla selezione degli anticorpi rende facile scegliere la giusta combinazione di anticorpi. Prende in considerazione la specie del campione, la specie ospite, il livello desiderato di specificità e le preoccupazioni di cross-reattività, tra gli altri fattori. La guida alla selezione degli anticorpi vi condurrà alle migliori opzioni per gli anticorpi monouso o quelli che si intende utilizzare in più applicazioni. La giusta combinazione di anticorpi mirati agli epitopi strategici porterà chiarezza allo stato di qualsiasi cascata di segnalazione intracellulare.