Attivazione di RNase H

RNase H è un enzima ubiquitario che degrada il filamento di RNA di un duplex RNA–DNA. È stato identificato in organismi diversi come virus e cellule umane (Crouch e Dirksen, 1985). Nelle cellule eucariotiche sono state identificate almeno due classi di RNasi H. Enzimi multipli con attività della RNasi H sono stati osservati nei procarioti (Crouch e Dirksen, 1985). Sebbene la RNasi H sia coinvolta nella replicazione del DNA, può svolgere altri ruoli nella cellula e si trova nel citoplasma e nel nucleo (Crum et al., 1988). Tuttavia, si ritiene che la concentrazione dell’enzima nel nucleo sia maggiore e alcuni degli enzimi presenti nei preparati citoplasmatici possono essere dovuti a perdite nucleari.

Gli elementi di riconoscimento precisi per RNase H non sono noti. Tuttavia, è stato dimostrato che oligonucleotidi con proprietà simili al DNA, brevi come i tetrameri possono attivare la RNasi H (Donis-Keller, 1979). I cambiamenti nell’attivazione di RNasi H di influenza dello zucchero come modifiche dello zucchero che provocano gli oligonucleotidi RNA-simili, per esempio 2′-fluoro o 2 ‘ – metossi non sembrano servire da substrati per RNasi H (Sproat et al., 1989; Kawasaki et al., 1993). Le alterazioni nell’orientamento dello zucchero alla base possono anche influenzare l’attivazione della RNasi H poiché gli α-oligonucleotidi non sono in grado di indurre la RNasi H o possono richiedere ricottura parallela (Gagnor et al., 1989; Morvan et al., 1991). Inoltre, le modifiche della spina dorsale influenzano la capacità degli oligonucleotidi di attivare la RNasi H. I metilfosfonati non attivano la RNasi H (Maher et al., 1989; Miller, 1989). Al contrario, i fosforotioati sono substrati eccellenti (Cazenave et al., 1989; Mirabelli et al., 1991; Stein e Cheng, 1993). Inoltre, le molecole chimeriche sono state studiate come oligonucleotidi che si legano all’RNA e attivano la RNasi H (Furdon et al., 1989; Quartin et al., 1989). Ad esempio, gli oligonucleotidi costituiti da ali di 2’-metossi fosfonati e un gap di cinque basi di desossioligonucleotidi si legano al loro RNA bersaglio e attivano la RNasi H (Furdon et al., 1989; Quartin et al., 1989). Inoltre, un singolo ribonucleotide in una sequenza di desossiribonucleotidi ha dimostrato di essere sufficiente a fungere da substrato per la RNasi H quando legato al suo deossi-oligonucleotide complementare (Eder e Walder, 1991).

È stato anche dimostrato che è possibile sfruttare oligonucleotidi chimerici progettati per attivare la RNasi H e avere una maggiore affinità per i loro recettori RNA e per migliorare la specificità (Giles e Tidd, 1992; Monia et al., 1993). In uno studio, la scissione mediata da RNasi H della trascrizione target era molto più selettiva quando i deossioligonucleotidi composti da ali di deossioligonucleotide di metilfosfonato e lacune di fosfodiestere sono stati confrontati con oligonucleotidi fosfodiesterici completi (Giles e Tidd, 1992).

Nonostante le informazioni sulla RNasi H e la dimostrazione che molti oligonucleotidi possono attivare la RNasi H nel lisato e nei saggi enzimatici purificati, relativamente poco è ancora noto sul ruolo delle caratteristiche strutturali nei bersagli di RNA nell’attivazione della RNasi H (Minshull e Hunt, 1986; Gagnor et al., 1987; Walder e Walder, 1988). Infatti, la prova diretta che l’attivazione della RNasi H è, infatti, il meccanismo d’azione degli oligonucleotidi nelle cellule è stata, fino a poco tempo fa, carente.

Recenti studi nei nostri laboratori forniscono ulteriori, anche se indiretti, approfondimenti su queste domande. ISIS 1939 è un fosforotioato 20 mer complementare ad una sequenza nella regione 3 ‘ – non tradotta di ICAM-1 RNA (Chiang et al., 1991). Inibisce la produzione di ICAM nelle cellule endoteliali della vena ombelicale umana e le macchie settentrionali dimostrano che l’mRNA ICAM-1 viene rapidamente degradato. Un analogo 2 ‘ – metossi di ISIS 1939 mostra una maggiore affinità per l’RNA rispetto al fosforotioato, è stabile nelle cellule, ma inibisce la produzione di proteine ICAM-1 molto meno potente di ISIS 1939. È probabile che ISIS 1939 destabilizzi l’RNA e attivi la RNasi H. Al contrario, ISIS 1570, un fosforotioato 18-mer che è complementare al codone di iniziazione della traduzione del messaggio ICAM-1 ha inibito la produzione della proteina, ma non ha causato alcuna degradazione dell’RNA. Pertanto, due oligonucleotidi che sono in grado di attivare la RNasi H hanno avuto effetti diversi a seconda del sito nell’mRNA a cui si sono legati (Chiang et al., 1991). Una dimostrazione più diretta che la RNasi H è probabilmente un fattore chiave nell’attività di molti oligonucleotidi antisenso è stata fornita da studi in cui la PCR di legatura inversa è stata utilizzata per identificare i prodotti di scissione da mRNA bcrabl in cellule trattate con oligonucleotidi fosforotioato (Crooke et al., 1995).

Dato il ruolo emergente degli oligonucleotidi chimerici con modifiche nelle ali 3′- e 5′-progettate per migliorare l’affinità per l’RNA bersaglio e la stabilità della nucleasi e un gap di tipo DNA per servire da substrato per la RNasi H, gli studi focalizzati sulla comprensione degli effetti di varie modifiche sull’efficienza dell’enzima(s) sono anche di notevole importanza. In uno di questi studi su E. coli RNase H, abbiamo riportato che l’enzima mostra una specificità minima della sequenza ed è processivo. Quando un oligonucleotide chimerico con zuccheri modificati 2′ nelle ali è stato ibridato all’RNA, il sito iniziale di scissione era il nucleotide adiacente alla giunzione metossi-deossi più vicina all’estremità 3’del substrato dell’RNA. Il tasso iniziale di scissione è aumentato man mano che la dimensione del gap di DNA è aumentata e l’efficienza dell’enzima è stata considerevolmente inferiore contro un bersaglio di RNA duplex con un oligonucleotide antisenso chimerico rispetto a un oligonucleotide di tipo DNA completo (Crooke et al., 1995).

In studi successivi, abbiamo valutato le interazioni degli oligonucleotidi antisenso con obiettivi strutturati e non strutturati e gli impatti di queste interazioni sulla RNasi H in modo più dettagliato (Lima e Crooke, 1997). Utilizzando una serie di substrati non scindibili e analisi di Michaelis-Menten, siamo stati in grado di valutare sia il legame che la scissione. Abbiamo dimostrato che, in effetti, E. coli RNase H1 è una proteina legante l’RNA a doppio filamento. Il Kd per l’RNA duplex era di 1,6 µM; il Kd per un DNA duplex era di 176 µM; e il Kd per il DNA a singolo filamento era di 942 µM. Al contrario, l’enzima poteva solo fendere l’RNA in un duplex RNA-DNA. Qualsiasi modifica di 2 ‘ nel farmaco antisenso nel sito di scissione ha inibito la scissione, ma una significativa riduzione della carica e modifiche di 2’sono state tollerate nel sito di legame. Infine, l’immissione di una carica positiva (ad esempio 2’-propossiamina) nel farmaco antisenso ha ridotto l’affinità e la scissione. Abbiamo anche esaminato gli effetti delle strutture di RNA indotte da oligonucleotide antisenso sull’attività di E. coli RNasi H1 (Lima e Crooke, 1997). Qualsiasi struttura nel substrato duplex è stata trovata per avere un effetto negativo significativo sul tasso di scissione. Inoltre, la scissione di siti selezionati è stata inibita completamente, e questo è stato spiegato dall’ostacolo sterico imposto dal ciclo di RNA che attraversa i solchi minori o maggiori o l’eteroduplex. Recentemente abbiamo clonato ed espresso umano RNase H1. La proteina è omologa alla RNasi H1 di E. coli, ma ha proprietà simili a quelle descritte per la RNasi H umana di tipo 2 (Frank et al., 1994; Wu et al., 1998). L’enzima è stimolato da basse concentrazioni di Mg2+, inibito da concentrazioni più elevate, ed è inibito da Mn2 + in presenza di Mg2+. È di 33 kDa in peso molecolare. È una proteina legante RNA a doppio filamento e presenta preferenze posizionali e di sequenza uniche per la scissione (Wu et al., 1999). Inoltre, la RNasi umana H2 è stata clonata, ma ad oggi la proteina espressa non ha dimostrato di essere attiva (Frank et al., 1998). Molto recentemente, abbiamo riportato gli effetti di diverse mutazioni introdotte nella RNasi umana H1 sull’attività dell’enzima (Wu et al., 2000). Pertanto, ora abbiamo gli strumenti necessari per iniziare a esplorare i ruoli della RNasi H umana nei processi biologici e farmacologici e per iniziare a sviluppare farmaci progettati per interagire con loro in modo più efficace.

Infine, almeno per quanto riguarda la degradazione indotta da RNasi H dell’RNA mirato, abbiamo recentemente dimostrato che nell’intervallo di 1-150 copie di RNA per cellula, il livello di RNA bersaglio non ha alcun effetto sulla potenza degli inibitori antisenso (Miraglia, 2000). Ciò è dovuto al fatto che il numero di molecole di farmaco antisenso per cellula supera il numero di copie di RNA di diversi ordini di grandezza. Pertanto, altri fattori devono essere limitanti.