Un metodo altamente efficiente di trasferimento genico nella cellula di mammifero è attraverso l’infezione con vettori retrovirali. L’efficienza dell’infezione retrovirale è migliorata significativamente, da 100 a 1.000 volte in alcune cellule, includendo il polibrene durante l’infezione. Il polibrene con uno shock DMSO è anche usato per mediare il trasferimento del DNA in una varietà di tipi di cellule, come CHO, fibroblasti di embrioni di pollo, NINH-3T3 e cellule mieloidi.
Protocollo: Infezione retrovirale
Le scorte retrovirali ricombinanti vengono preparate aggiungendo 5mls di terreno di crescita con siero al 5% a un monostrato quasi confluente di cellule di imballaggio retrovirali trasfette in una piastra da 100 mm. Dopo 24 ore il mezzo viene rimosso e filtrato attraverso un filtro da 0,45 um.
Le cellule da infettare con questo stock retrovirale ricombinante sono placcate a 500.000 cellule per piastra 100mm in 10mls di mezzo completo.
24 ore dopo, rimuovere il mezzo di crescita dalle cellule. Infettare le cellule con 2 ml del surnatante virale (o una diluizione dello stock virale in 2 ml) in presenza di 5ug a 10ug di polibrene per ml (concentrazione finale). Incubare le cellule per 3-6 ore a 37 ° C.
Aggiungere 8 ml di mezzo completo. Tre giorni dopo l’infezione, dividere le cellule 1:5 in mezzo di selezione.

Toyoshima, K. e Vogt, P. K., 1969. Virologia. 38: 414-426
Coelen, J. R., Jose, D. G. e maggio, J. T. 1983. Arco. Virol. 75: 307-311
Protocollo: Trasfezione
Cellule di placche a circa il 50% di confluenza nel mezzo di crescita completo.
18-24 ore dopo la placcatura, preparare la soluzione di DNA-Medio-polibrene, immediatamente prima dell’uso come segue:
Nota: Ogni componente deve essere aggiunto nella sequenza corretta.
1°: Terreno di crescita completo (2mls per una piastra da 60 mm e 3mls per una piastra da 100 mm) riscaldato a 37 ° C.
2°: DNA plasmidico, da 10ng a 10ug. Mescolare delicatamente.
3°: Polibrene ad una concentrazione finale di 5ug a 10ug per ml. Mescolare delicatamente
Rimuovere il mezzo dalla piastra e aggiungere la soluzione di DNA-Medio-polibrene alle cellule. Incubare le cellule a 37°C per 6-20 ore con occasionali oscillazioni dolci circa ogni 1.5 ore per le prime 6 ore.
Rimuovere la soluzione di DNA-Medio-polibrene e sovrapporre delicatamente le cellule con DMSO shock solution (15% DMSO in 1X HBSS: Specialty Media catalog #S-051-D) 3mls per piatto da 60 mm e 4mls per piatto da 100 mm. Manualmente rock il piatto per 10 secondi per distribuire uniformemente la soluzione, e poi incubare le cellule per esattamente 4 minuti a 37°C.
rimuovere Immediatamente il DMSO shock soluzione e sciacquare delicatamente le cellule due volte con il completo mezzo di crescita, 5km per lavare a 60mm piatto, 10mls per lavare a 100mm piatto
Aggiungere completo mezzo di crescita per le cellule.
Per i trasformanti stabili, rimuovere i mezzi di crescita e dividere le cellule 1:5 in mezzo di selezione.
Per l’espressione transitoria, rimuovere il mezzo di crescita e aggiungere il mezzo di crescita fresco. Raccogliere le cellule e / o il terreno dopo 24-72 ore.

Chaney, W. G. et al., 1986. Genetica cellulare somatica e Molecolare. Vol. 12, n. 23,
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Chisholm, O. et al., 1998. Ricerca sugli acidi nucleici. Vol. 16, No. 5, 2352
Il reagente viene fornito filtrato attraverso membrane 0.2 um e idratato con H20 sterile.