抗菌感受性における髄膜炎菌PorAおよびPorB発現の役割 | Company Pride
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髄膜炎菌Neisseria poraは、潜在的に致命的な全身疾患を引き起こす可能性があります。 早期診断と迅速な抗菌介入は、良好な臨床転帰のために重要です。 抗生物質耐性は、ペニシリン（1）、テトラサイクリン（2）、およびスルホンアミド（3）だけでなく、キノロン（4）とリファンピン（5）のために報告されています。
N. meningitidisは、二つの主要なポリン、PorAとPorBを発現し、菌株間および菌株内で抗原的に可変であり、PorAは位相可変（ランダムなオン/オフスイッチング）である（6）。 Neisseria gonorrhoeaeは単一のporin、PorBを表現します。 ポリン発現または変異型ポリンの変化は、n.gonorrhoeaeを含むいくつかのグラム陰性細菌における抗生物質耐性を媒介する（7、-10）。 N.髄膜炎菌では、PorBの不在は、in vitroでテトラサイクリンとセフスロジンに対する抵抗性を増加させる（11）。 抗菌抵抗性におけるＰｏｒａの役割は髄膜炎菌に対しては報告されていない。 免疫回避におけるその提案された役割に加えて、我々は、PorAが抗生物質の取り込みまたは排除を仲介する場合、相可変PorAの発現は、髄膜炎菌が抗菌剤を ＰｏｒａまたはＰｏｒｂを欠く株を生成し，ＭＩＣアッセイを行った。 我々はまた、変更されたPorAの発現は、MICアッセイの過程で抗菌暴露によって選択されるかどうかをテストしました。
隣接配列を有するporAおよびporB遺伝子は、N.meningitidis株MC58から増幅され、pGEM T-easyにクローニングされた。 逆ＰＣＲに続いて自己ライゲーションを行ったところ，内部欠失と制限部位を導入したプラスミドが得られた。 LacZ/カナマイシンカセット（12）は、プラスミドpPorALacZKanをもたらし、削除されたPorA対立遺伝子の導入されたSmaIサイトにクローニングされました。 クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を増幅し，プラスミドｐｐｏｒｂ：ＣＡＴ中の欠失ｐｏｒｂ対立遺伝子の導入Ｂｇｌｉｉ部位にクローニングした。 PorA lacZ kanまたはporB::cat構築物をN.meningitidis株≥9(13)に形質転換し、株≥9δ poraおよび≥9δ porbを得た。 野生型ＰＯＲＡまたはＰＯＲＢ対立遺伝子の変異対立遺伝子への対立遺伝子置換は、ＰＣＲおよび配列決定、ならびにサルコシル抽出外膜タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確 1A）。
MIC分析中のポリン発現の分析。 （A）膜タンパク質は、サルコシル抽出によって単離され、10μ gは、Coomassie染色の前に8-12％ビス-トリスアクリルアミドゲル上で分離された。 レーン1,≥9;レーン2,≥9δ pola;レーン3,≥9δ polb. （Ｂ）濁りを示す最後のウェルからの試料をＢＨＩ寒天上に播種し、Ｐｏｒａ特異的Ｍａｂ ＭＮ１ ４Ｃ１ １.６で免疫ブロットした。
MICは、96ウェルプレート（14）でブロスマイクロダイリューションメソッドによって評価され、37℃で補充されたBHI寒天上で一晩成長し、約4時間bhiブロス中で37℃で約5×105CFU/mlに調整する前に、600nm（OD600）での光学密度に基づいて約5×105CFU/mlに調整された細菌を用いて37℃で培養した。 連続的に希釈した抗生物質に５ ０μ ｌを添加した後、濁りが観察されなかった濃度として、３ ７℃で一晩増殖した後（表１）、Ｍｉｃを記録した。 各アッセイは、３回、各回、３回実施した。 各処置のために、Ｍｉｃは、アッセイ内およびアッセイ間で同一であった。野生型および突然変異体NのMic。
表1
野生型および突然変異体NのMic。 p>
| 抗生物質 | MIC(μ g/ml) | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| MIC(μ g/ml) | |||||||||
| Mic(μ g/ml) | |||||||||
| Mic(μ g/ml) | |||||||||
| Mic(μ g/ml)1″colspan=”1″>¢9 | ¢9δ pora | ¢9δ pora | ¢9δ pora | ||||||
| cefotaxime | 0.003125 | 0.003125 | 0.003125 | 0.003125 | 0.003125 | 0.00312500625 | |||
| Ceftazidime | 0.03125 | 0.03125 | 0.0625 | 0.0625 | |||||
| セファロシン | 0.3125 | 0.3125 | 0.625 | ||||||
| 0.625 | |||||||||
| 0.3125 | 0.625 | ||||||||
| 0.625″colspan=”1″>アンピシリン | 0.0625 | 0.0625 | 0.0625 | 0.0625 | 0.0625 | 0.06250625 | |||
| カルベニシリン | 0.0625 | 0.0625 | 0.0625 | 0.0625 | |||||
| クロキサシリン | 1.25 | 1.25 | 1.25 | ||||||
| 1.25 | |||||||||
| 1.25 | |||||||||
| 1.25 | |||||||||
| ペニシリンg | 0.03125 | 0.03125 | 0.03125 | 0.03125 | 0.03125 | ||||
| ピペラシリン | 0.03125 | 0.03125 | 0.015625 | 0.015625 | 0.03125 | 0.03125 | 0.015625 | 0.3125 | 0.625 |
| テトラサイクリン | 0.3125 | 0.625 | |||||||
| 0.3125 | 0.625 | ||||||||
| 0.625 1″colspan=”1″>ドキシサイクリン | 0.1875 | 0.1875 | 0.1875 | 0.1875 | 0.1875 | 0.1875375 | |||
| シプロフロキサシン | 0.003125 | 0.003125 | 0.00625 | 0.003125 | 0.00625 | 0.003125 | 0.00625 | ||
| ナリジキシ酸 | 1.25 | 1.25 | 1.25 | ||||||
| 1.25 | |||||||||
| 1.25 | |||||||||
| 1.25 | |||||||||
| 1.25 | |||||||||
| 1.25colspan=”1″>imipenem | 0.0625 | 0.0625 | 0.0625 | 0.0625 | 0.0625 | 0.06251″Colspan=”1″>0.125 | 0.125 | 0.0625 | |
フルオロキノロンの使用は、もはや淋菌感染症（18）のために推奨されておらず、n.gonorrhoeaeのPorb1Bの点変異は、シプロフロキサシンに対するn.gonorrhoeaeの感受性の低下 淋菌性ポリンの発現変化はシプロフロキサシン耐性を変える（19）;我々は髄膜炎菌性PorBの変異はまた、減少したシプロフロキサシン感受性をもたらすことが 逆に、この株は、コリスチン耐性Acinetobacter baumannii（20）の変更されたリファマイシン耐性のために示唆されているように、おそらく変更された膜アーキテクチャを介して、髄膜炎菌予防のための他の主要な選択であるリファンピンの影響を受けやすくなった。対照的に、試験したいずれの抗生物質についても、pora+親株と比較して≥9δ poraの感受性に変化は認められなかった（表1）。
対照的に、試験した抗生物質のいず これは、いずれかのPorAは、細胞への抗菌剤のエントリに直接の役割を持っていないか、親株または≥9δ portbのいずれかで、潜在的にPorAを介した抗生物質のエ これを評価するために、本発明者らは、濁りが観察された最終ウェルから細菌を単離し、抗P1.7マウスモノクローナル抗体（MAb）MN14C11.6（NIBSC、United Kingdomから得られた）を用いたコロニー免疫ブロッティングによってPorA発現を評価した。 対照として、親株≥9とPorA変異株≥9δ poraとの間の反応性を比較した。 これは、対照ウェル間および試験された抗菌剤のいずれかへの曝露後に、Ｐｏｒａ発現が変化しないことを示した（図１ ０を参照）。 1B);したがって、≥9δ portbの感受性の低下は、PorA発現レベルの変化によるものではない。
我々の結果は、セファロスポリンとテトラサイクリン耐性（9、11、15）におけるN.meningitidis PorBの役割のための以前のレポートと一致しています。 抗生物質耐性に関する淋菌Porb1Bとの類似点は顕著である。 Ｐｏｒｂ発現をノックアウトすることはまた，増殖耐性ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに対する推奨療法の一つであるドキシサイクリンに対する髄膜炎菌感受性を減少させた。 厄介なことに、これは、選択的圧力が減少したドキシサイクリン感受性を有する淋菌PorB変異体の出現につながる可能性があることを示唆している。 我々は、治療の失敗につながることを単独ではほとんどありません唯一の2倍の違いを記録したが、他の変異とPorB変異の相乗効果は、髄膜炎菌と淋菌 我々は、外膜を横切って抗菌輸送におけるPorAの役割の証拠を発見しませんでした。