proefpersonen, klinische specimens en HLA-genotypering. Alle proefpersonen met een voorgeschiedenis van bloedtransfusie werden uitgesloten van de studie. 32 families met een geschiedenis van simplex sclerodermie werden gerekruteerd en bestudeerd voor HLA klasse II en klasse I allelen; 3 generaties werden bestudeerd voor 20 families en 2 generaties voor 12 families. Voor alle vrouwen met kinderen waren drie generaties nodig voor deelname aan de studie, en deelname van alle kinderen was vereist omdat microchimerisme bij deze proefpersonen afkomstig kon zijn van de moeder of van een kind. De deelname van mannen, kinderen en nooit-zwangere vrouwen omvatte 2 generaties (d.w.z. het onderwerp en de moeder). Eén sclerodermie-patiënt was een tweeling; de onaangetaste tweeling werd ook voor de studie gerekruteerd. Drieëndertig gezonde controlefamilies werden gerekruteerd, waarvan 22 met 3 generaties en 11 met 2 generaties. HLA genotypering werd voltooid voor een totaal van 254 individuen: 128 in scleroderma families en 126 in controles. Enkele extra familieleden werden opgenomen om HLA haplotypische toewijzingen te bevestigen. Uit deze database werden proefpersonen geselecteerd voor verdere studie wanneer de moeder van de proefpersoon een niet-gedeeld HLA-allel had dat door HLA-specifieke analyses werd gericht. Alle proefpersonen kregen informed consent zoals goedgekeurd door het Fred Hutchinson Cancer Research Center Institutional Review Board.

PBMC ‘ s werden geïsoleerd uit volledig hepariniseerd bloed door verdunning in HBSS, gevolgd door ficoll-Hypaque (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Zweden) gradiëntcentrifugatie bij 1,077 g/mL. Voor sommige kinderen werd DNA uit haarwortels geëxtraheerd voor HLA-typering zoals eerder beschreven (9). Genomisch DNA werd geëxtraheerd uit PBMC ‘ s met behulp van een Isoquick nucleïne extractie Kit (Orca Research Inc., Bothell, Washington, USA), volgens de instructies van de fabrikant, en geresuspendeerd in 10 mM Tris-HCl (pH 9,0). De hoeveelheid en de zuiverheid van DNA werden bepaald door standaard spectrofotometrische methoden. Voor sommige proefpersonen werd DNA direct uit volbloed monsters gehaald.

DNA-gebaseerde typering met sequentiespecifieke oligonucleotide-sondepanelen werd gebruikt om specifieke allelen op de drb1 -, DRB3 -, DRB4 -, DRB5 -, DQA1-en DQB1-loci te identificeren. Voor DRB1 detecteert een initiële lage-resolutie-test DRB1-families DBR1 * 01 tot DRB1 * 14 en wordt gevolgd door 1 of meer hoge-resolutie-tests die specifieke DRB1-allelen identificeren zoals eerder beschreven (10, 11). Dqa1-en dqb1-allelen werden bepaald met methoden die vergelijkbaar zijn met de eerder beschreven methoden (9), met extra sondes toegevoegd om nieuw geïdentificeerde allelen te detecteren (12). HLA-klasse I-antigenen werden bepaald met behulp van een standaard lymfocytotoxiciteitstest die 20 HLA-a -, 30 HLA-B-en 8 HLA-Cw-antigenen discrimineert. Sommige monsters werden onderworpen aan sequencing om specifieke HLA klasse I allelen te bepalen (13). Om HLA-allel-en antigeentoewijzingen en homozygositeit te bevestigen, werden meerdere familieleden gegenotypeerd-inclusief vaders en broers en zussen van proefpersonen, indien beschikbaar.

HLA-specifieke PCR-primers. Primer sequenties werden ontworpen op basis van alle bekende allel sequenties (12). Primer synthese werd gedaan door Oligos Etc. (Wilsonville, Oregon, USA). Een primer set werd ontworpen om een HLA klasse I polymorfisme en 3 gerichte HLA klasse II polymorfismen te richten. Om zich te richten op HLA-B44 werd een primer ontworpen die een groep HLA-B allelen versterkt op basis van polymorfismen op posities 66, 69 en 75 van exon 3 en een andere groep HLA-B allelen op basis van een polymorfisme op positie 229 van exon 3. De combinatie van primers versterkt specifiek HLA-B44 allelen, waardoor een 190-bp fragment ontstaat. Alle DRB-specifieke primers werden ontworpen om allelgroepen te versterken op basis van opeenvolgingspolymorfismen in het hypervariabele gebied van exon 2. Voor HLA-DRB5 * 01 versterkt één primer een groep van DRB5*01 allelen gebaseerd op polymorfismen op posities 25, 26, 31, 32 en 38, en de andere versterkt een groep van DRB5*01 allelen gebaseerd op polymorfismen tussen posities 215 en 231. De combinatie van primers versterkt specifiek HLA-DRB5*01 allelen en produceert een 210-bp fragment. Voor HLA-DRB1 * 04 versterkt één primer een groep van DRB1*04 allelen gebaseerd op polymorfismen op posities 25, 26, 31 en 36, en de andere versterkt een groep van DRB1*04 allelen gebaseerd op polymorfismen op posities 97 en 110. De combinatie van primers versterkt specifiek DRB1 * 04 en produceert een 104-bp fragment. Verdere discriminatie tussen DRB1 * 04 allelen werd bereikt door het gebruik van de voormalige primer samen met 1 van de 2 primers die een dimorfisme discrimineren op positie 258 (codon 86), wat een 263-bp fragment produceert. Voor HLA-DRB1 * 11 versterkt één primer een groep DRB1*11 allelen gebaseerd op polymorfismen op posities 25, 26, 28, 30, 31, 32, en 35 van exon 2, en de tweede primer versterkt een groep van DRB1 * 11 allelen gebaseerd op polymorfismen op posities 173 en 174 van exon 2. The combination of primers specifically amplifies DRB1*11 and produces a 178-bp fragment. Primer sequences are as follows: B44-specific primers 5′-TCC GCG GGT ATG ACC AGG A-3′ and 3′-TCC AGG TAT CTG CGG AGC G-5′; DRB5*01-specific primers 5′-TTC TTG CAG CAG GAT AAG TAT-3′ and 3′-GTA GTT GTC CAC CGC GGC G-5′; DRB1*04-specific primers 5′-CCA CGT TTC TTG GAG CAG GTT AAA-3′ and 3′-GCG CAC GTA CTC CTC TTG GTG-5′; DRB1*11-specific primers 5′-CA CGT TTC TTG GAG TAC TCT AC-3′ and 5′-CTG GCT GTT CCA GTA CTC CT-5′.

HLA-specific PCR for maternal microchimerism. PCR–reacties werden uitgevoerd in een volume van 50 µL met 1,25-1,5 µg genomisch DNA, 10 mmol/l Tris-HCl (pH 8,3), 50 mmol/L KCl, 1,5 mmol MgCl2, 0,001% gelatine wt/vol, 260 µmol/l van elk deoxynucleotide, 0,5 u perfecte Match PCR-Versterker (Stratagene, La Jolla, Californië, VS), 2,5 u AmpliTaq Gold DNA-polymerase (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, Californië, VS), en 20 pmol van elke HLA-specifieke primer. Ultrapuur water werd toegevoegd aan het uiteindelijke volume van 50 µL. De versterking bestond uit 5 minuten bij 96°c, 35 cycli bij 95 ° C gedurende 35 seconden, en bij 65°C gedurende 35 seconden voor HLA-B44 (58,5°C voor DRB5*01; 72°C voor DRB1*04; 64,5°C voor DRB1*11), vervolgens 72°C gedurende 1 minuut, met een laatste verlengstap bij 72°C gedurende 10 minuten. De optimale versterking, gevoeligheid, en specificiteit werden bereikt door MgCl2, en inleidingsconcentraties, aantal thermocycles, en het ontharden temperatuur te titreren. Alle versterkingen werden uitgevoerd in een GeneAmp systeem 9600 thermocycler (Perkin-Elmer Applied Biosystems). De gevoeligheid van de analyse werd bepaald door experimenten waarbij doeldna in serie werd verdund en toegevoegd aan een vaste hoeveelheid achtergronddna die aan allelen van het onderwerp corresponderen. De HLA– B44-en DRB5*01-specifieke PCR– analyses konden minstens 1 doelcel op een achtergrond 500.000 cellen ontdekken; de HLA-DRB1*04-en DRB1*11-specifieke PCR-analyses konden minstens 1 doelcel op een achtergrond van 100.000 cellen ontdekken. Elke PCR-test omvatte de volgende controles: a) een positieve controle van DNA uit een cellijn met het relevante HLA-allel (0,2-0,5 µg); b) een positieve controle door de moeder van de proefpersoon (0,2–0,5 µg); c) een negatieve controle van DNA van een cellijn met dezelfde HLA-allelen als de proefpersoon (1,25 µg en 0,35 µg); en d) een negatieve controle van alle PCR-reagentia zonder DNA. PCR-producten werden gedurende 1 uur elektroforeerd bij een constante spanning van 100 V in 6% of 8% TBE-gels met behulp van een Novex Xcell II Minicel (Novex, San Diego, Californië, VS). Elke gel bevatte positieve en negatieve PCR-controles en een 100-BP ladder (SLL-100; Gensura, Del Mar, Californië, VS). Gels werden gekleurd met silver stain (Silver Stain Plus Kit, Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, California, USA) en gedroogd met het DryEase Gel droogsysteem (Novex). DNA uit volbloed werd getest in 4 monsters van onvoldoende hoeveelheid om PBMC ‘ s te isoleren. Alle tests werden in duplo uitgevoerd en de meeste monsters werden meer dan eens onderzocht.

PCR voorzorgsmaatregelen. Uiterste voorzichtigheid werd toegepast om mogelijke PCR-besmetting te vermijden en op te sporen. De afzonderlijke gebieden werden gebruikt voor PBMC scheiding, extractie van genomic DNA, PCR opstelling en versterking, en analyse van PCR producten, met before-and-after PCR tests die in afzonderlijke laboratoria worden uitgevoerd. Aerosol-resistente pipettips (Molecular Bio-Products Inc., San Diego, Californië, USA) werden gebruikt in alle experimenten, en meerdere negatieve controles werden opgenomen in alle PCR versterkingen.

Sequencing van HLA-specifieke PCR-producten. Zeven microliters van het oorspronkelijke HLA-specifieke PCR-product werden onderworpen aan 40 extra versterkingscycli met behulp van de oorspronkelijke thermocyclingparameters. Dertig microliters van dit PCR-product werden elektroforeerd in een 1,75% ultrapure agarose gel (GIBCO BRL, Grand Island, New York, USA) en gekleurd met een oplossing van ethidiumbromide (0,5 µg/mL). De band werd uitgesneden, geëlueerd en gezuiverd met behulp van een Qiaquick Gel extractie Kit (QIAGEN Inc., Valencia, Californië, USA). Het gezuiverde PCR-product werd geëlueerd in 30 µL van 10 mmol Tris-HCl (pH 9,0), en 100 ng werd toegevoegd aan een reactiemengsel met 8,0 µL sequencing reagens pre-mix (Thermo Sequenase; Amersham Corp., Arlington Heights, Illinois, USA), 12.5 pmol 5′ of 3′ primer en 1 µL DMSO (Sigma Chemical Co. Louis, Missouri, USA). Ultrapuur water werd toegevoegd om een eindvolume van 20 µL te maken. De sequencing reactiemengsels werden verwarmd bij 96°C gedurende 3 minuten in een GeneAmp-systeem 9600 thermocycler, gevolgd door 25 cycli bij 96°C gedurende 10 Seconden, 50°C gedurende 5 seconden en 60°C gedurende 4 minuten. Resulterende PCR producten werden kolom gezuiverd en elektroforesed zoals hierboven. Sense en antisense sequenties werden bepaald in duplicaat voor het onderwerp en de moeder HLA-specifieke PCR producten, evenals voor positieve controle cel lijn PCR producten. Sequence analysis werd uitgevoerd met behulp van Wisconsin Package Versie 9.1 software van Genetics Computer Group (Madison, Wisconsin, USA).

bereiding van Cytospindia en hybridisatie in situ. De preparaten van de cytospindia werden geanalyseerd op de aanwezigheid van chromosoomspecifieke sequenties van X en Y, gebruikend een techniek die in het Fred Hutchinson Cancer Research Center Molecular Cytogenetics Laboratory voor kwantitatieve analyse van chimerisme in geslacht-mismatched stamceltransplantatieparen werd ontwikkeld (14). Cytospinmonsters van mannelijke cellen werden bereid door middel van centrifugering van 30.000–60.000 vers gescheiden PBMC ‘ s op glazen objectglaasjes, 300 µL per objectglaas. De dia ‘ s werden tot gebruik in een droogkamer bewaard. De X chromosoom-specifieke sonde DXZ1 (15) werd nick-vertaald met digoxigenine, en de Y chromosoom–specifieke sonde DYZ1 (16) werd nick-vertaald met biotine. Het XY-sondemengsel had een eindconcentratie van 0,5 µg / mL van elke sonde in hybridisatiebuffer van 50% formamide, 2 × SSC (0,3 m natriumchloride en 0,03 m natriumcitraat) en 10% dextraansulfaat. Het werd gedurende 5 minuten bij 72°C gedenatureerd, op ijs afgekoeld en op het objectglaasje aangebracht. De objectglaasjes werden verteerd in pepsine (0,1 mg / mL in 0).01 M HCl) bij 37°C gedurende 3 minuten, gedurende 15 minuten gefixeerd in 4% gebufferde formaline, gespoeld in PBS, gedehydrateerd in ethanol (70%, 95% en 100%) en aan de lucht gedroogd. De objectglaasjes werden gedenatureerd door behandeling in 2 × SSC (72°C) gedurende 10 minuten, 70% formamide, 2× SSC (72°C) gedurende 3 minuten, gedehydreerd in een ethanolreeks (-20°C) en aan de lucht gedroogd. Tien microliters van de sonde werd aangebracht op de slide en vervolgens gemonteerd onder een coverslip (22 × 22 mm) verzegeld met rubber cement. Het werd ‘ s nachts bij 42°C uitgebroed in een bevochtigde kamer. De glaasjes werden gewassen in 55% formamide, 2× SSC (45°C) gedurende 15 minuten en 2× SSC (kamertemperatuur) gedurende 5 minuten. Sondesignalen werden gelijktijdig gedetecteerd met fluoresceïne-gekoppeld anti-digoxigenine (1:500 verdunning; Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana, USA) en Texas rood–gekoppeld avidine (1:500 verdunning; Vector Laboratories, Burlingame, Californië, USA) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Na het wassen met 2 × SSC en PBS, werden ze gemonteerd met VECTASHIELD (Vector Laboratories). De objectglaasjes werden direct geëvalueerd met behulp van een Nikon E600 epifluorescentiemicroscoop met een 100-W kwiklamp uitgerust met geschikte enkele, dubbele en drievoudige banddoorlaatfilters. Alleen cellen met 2 zichtbare chromosoomsignalen werden opgesomd, zonder enige elektronische verbetering te gebruiken.