2.1 anaërobe ademhaling

tijdens de ademhaling oxideren verschillende membraangeassocieerde dehydrogenasen in water oplosbare substraten en reduceren menaquinon (MK) in het membraan tot menaquinol. Onder aërobe omstandigheden worden de elektronen gebruikt om zuurstof naar water te reduceren, terwijl tijdens anaërobe omstandigheden, nitraat respiratoire groeielektronen worden overgebracht naar nitraat om nitriet te produceren (Fig. 5.1). Een belangrijke elektronendonor van ademhaling is NADH + h + geproduceerd in glycolyse en de tricarbonzuurcyclus. Twee types van membraan-gebonden NADH dehydrogenases, NDH-I en NDH-II, zijn beschreven voor bacteriën om de oxidatie van NADH+H+ aan NAD+ (Yagi, 1993) te katalyseren. NDH-I bestaat uit 14 subeenheden, gecodeerd door het nuo–operon in Escherichia coli, en bevat flavinmononucleotide (FMN) en verscheidene ijzer-zwavelclusters om elektronenoverdracht te koppelen aan proton die over het membraan pompen. NDH-II bestaat uit één enkele subeenheid die door het gen NDH wordt gecodeerd. NDH-II is geen integraal membraanproteã ne maar geassocieerd met de binnenzijde van het cytoplasmic membraan. Het bevat flavinadenine dinucleotide (FAD) aangezien de prothetische groep en de elektronenoverdracht niet aan protontranslocatie wordt gekoppeld. In het B. subtilis genoom coderen drie genen, yjlD, yumB en yutJ, potentiële NADH dehydrogenases van het NDH-II type, terwijl een nuo operon ontbreekt in het B. subtilis genoom (Kunst et al., 1997). YjlD, hernoemd tot Ndh, bestaat uit 392 aminozuurresiduen en toont 29% sequentie-identiteit aan NDH-II van E. coli (Bergsma, van Dongen, & Konings, 1982). Interessant is dat de hoeveelheid NDH-eiwit van B. subtilis werd significant verminderd onder anaërobe omstandigheden (Marino, Hoffmann, Schmid, Mobitz, & Jahn, 2000). Ndh lijkt de belangrijkste aërobe NADH dehydrogenase van B. subtilis te zijn, aangezien de mutatie van het NDH-gen een aërobe groeidefect vertoonde (Gyan, Shiohira, Sato, Takeuchi, & Sato, 2006). Ondertussen werd aangetoond dat de expressie van het yjlc-NDH operon wordt gereguleerd door de Rex regulator, een redox-sensing transcriptionele regulator, die reageert op de NADH/NAD+ ratio (zie ook paragraaf 3.3) (Gyan et al., 2006). In transcriptoomstudies (E. Härtig, ongepubliceerde resultaten) werd daarentegen de expressie van het yumB-gen geïnduceerd onder ademhalingsproblemen door nitraten. Of YumB en YutJ NADH-dehydrogenase-activiteit hebben, zoals gesuggereerd door de gelijkenis van de eiwitvolgorde, en of ze relevant zijn onder de groeiomstandigheden van de luchtwegen door nitraten, moet worden bepaald.

net als andere aërobe respirerende organismen bezit B. subtilis een succinaatdehydrogenase (sdh) of beter gezegd een succinaat:quinone oxidoreductase, SQR (hägerhäll, 1997). Het enzymcomplex is een integraal onderdeel van het cytoplasmatische membraan in bacteriën en het binnenste mitochondriale membraan in eukaryotes. Het katalyseert de oxidatie van succinaat tot fumaraat in combinatie met de vermindering van Chinon. Hierdoor is het enzym een functioneel onderdeel van zowel de citroenzuurcyclus als de ademhalingsketen (Hägerhäll, Aasa, von Wachenfeldt, hederstedt, 1992). SQR in B. subtilis vermindert MK en heeft drie eiwit subeenheden, SdhA, SdhB en SdhC. SdhA is een flavoprotein met één covalent gebonden Rage die de twee elektronenoxidatie van succinaat aan fumaraat in het cytoplasma uitvoert. SdhB bevat drie ijzer–zwavelclusters (, , en ) die in elektronenoverdracht tussen de flavingroep en heme b van cytochroom b558 in SDHC functioneren. SdhC heeft vijf transmembrane α-spiraalvormige segmenten en verankert het sdhab-dimeer aan de cytoplasmatische kant van het membraan en werkt in transmembrane electron transfer to MK (Hederstedt, Maguire, Waring, & Ohnishi, 1985; Matsson, Tolstoy, Aasa, & Hederstedt, 2000). De twee heme B-cofactoren bemiddelen de overdracht van elektronen over het cytoplasmatische membraan aan de buitenzijde van het membraan waarbij MK wordt verminderd en twee protonen worden verbruikt (Hederstedt, 2002). Dit verschilt van E. coli waar de protonen voor de reductie van ubiquinon tot ubiquinol worden geconsumeerd aan de negatieve kant van het membraan, wat geen invloed heeft op het membraanpotentieel. B. subtilis en andere bacillen, zoals Bacillus megaterium en Bacillus cereus stammen, kunnen groeien onder oxische omstandigheden met succinaat als koolstof-en energiebron (Schirawski & Unden, 1995, 1998).

B. subtilis, B. megaterium en B. cereus groeien niet onder anaërobe omstandigheden in aanwezigheid van glycerol. In overeenstemming, genen voor een glycerol-3-dehydrogenase ontbreken in de genomen. Echter, een glpD gen voor de aërobe variant van het membraan-gelokaliseerde elektronenoverdrachtsysteem werd gedetecteerd in B. subtilis. Er werd geen homologie gevonden voor genen die coderen voor andere primaire dehydrogenasen die aanwezig zijn in E. coli, zoals verschillende formaatdehydrogenase, hydrogenases, l-lactaatdehydrogenase, d-aminozuurdehydrogenase, malaat:quinonoxidoreductases, of de quinoproteïne glucose dehydrogenase. Uiteraard bezit B. subtilis slechts een beperkte reeks primaire elektron-donerende dehydrogenasen, namelijk verschillende vormen van NDH-II en aërobe glycerol-3-fosfaatdehydrogenase.

onder aërobe omstandigheden worden de elektronen van menaquinol via het cytochroom BC1-complex doorgegeven aan het cytochroom c-oxidase van het aa3-type. Onder microaerofiele voorwaarde wordt het cytochroom BD-type menaquinoloxidase met hoge zuurstofaffiniteit gebruikt. Fumaraat als terminale elektron acceptor werd uitgesloten voor verschillende bacillen, waaronder B. subtilis (Schirawski & Unden, 1995). Bijgevolg worden de genen voor een fumarate reductase niet gevonden in het genoom van B. subtilis. Andere bacillenstammen, zoals Bacillus licheniformis en Bacillus circulans, kunnen fumaraat respireeren zoals E. coli.

onder anaërobe groeiomstandigheden brengt subtilis de elektronen uitsluitend over op de respiratoire nitraatreductase. Bij bacteriën worden drie verschillende nitraatreductasesystemen ingedeeld: de cytoplasmatische Assimilatie NAD (P)H-afhankelijke nitraatreductasen( Nas), de membraangebonden respiratoire nitraatreductase (Nar) en de periplasmische ongelijksoortige nitraatreductasen (Nap). Alle drie behoren tot de DMSO reductase familie van eiwitten en bevatten de bis-molybdopterine guanine dinucleotide (MGD) cofactor (Moreno-Vivian, Cabello, Martinez-Luque, Blasco, & Castillo, 1999). Het B. subtilis genoom codeert alleen de respiratoire nitraatreductase Nar. Nar enzymen zijn typisch samengesteld uit drie subeenheden. De grote subeenheid NarG bevat de actieve plaats met de MGD-cofactor, een kleinere oplosbare subeenheid NarH herbergt één en drie centra, en subeenheid NarI is een cytochroom b. Nar is een chinoloxidase en de menaquinolpool wordt geoxideerd door de cytochroom B-subeenheid NarI. Twee elektronen stromen via de heme b van NarI naar de ijzer-zwavelclusters van NarH en tenslotte naar de cytoplasmatische subeenheid NarG die nitraat tot nitriet reduceert. Het NarJ-eiwit maakt geen deel uit van het enzym, maar is nodig voor de uiteindelijke assemblage van het membraangebonden enzym (Blasco, Iobbi, Ratouchniak, Bonnefoy, & Chippaux, 1990; Zakian et al., 2010). Door de verschillende plaatsen voor quinoloxidatie in het periplasma en voor nitraatreductie in het cytosol, draagt nitraatreductase Nar bij aan de vorming van een protongradiënt (Fig. 5.1). De nar-locus bestaat uit het narGHJI-operon (dat respiratoire nitraatreductase codeert), narK (voor een potentieel nitriet-extrusieproteïne), het open leesframe ywiC (met onbekende functie), arfM dat de modulator van anaerobe ademhaling en fermentatie codeert, en ook het gen voor de anaerobe regulator Fnr (Cruz-Ramos et al., 1995; Kunst et al., 1997).

nitriet wordt vervolgens verder omgezet in ammoniak door de assimilatoire nitriet reductase NASD (Cruz-Ramos et al., 1995; Hoffmann, Frankenberg, Marino, & Jahn, 1998; Hoffmann et al., 1995; Nakano & Zuber, 1998). Assimilatory of ammonium-producerende NADH-afhankelijke nitriet reductase is een siroheme-bevattend enzym dat de zes-elektronenreductie van nitriet aan ammonium katalyseert. De nitrietreductase genen NASD maakten deel uit van een nasDEF operon en werden direct na het nasbc operon gevonden, dat codeert voor de NADH-afhankelijke nitraatreductase (Nakano, Yang, Hardin, & Zuber, 1995; Ogawa et al., 1995).