Abstract

Myoepitheel is aanwezig in borsttumoren van honden als rustgevende en proliferatieve suprabasale en spindel-en stellaatinterstitiële cellen. Het doel van dit artikel was het evalueren van een panel van markers voor de identificatie van vier verschillende myoepitheliale celmorfologische types in de normale en neoplastische borstklier en het onderzoeken van immunohistochemische veranderingen van een epitheliaal naar een mesenchymaal fenotype. Cytokeratine 19 (CK19), cytokeratine 5/6 (CK5/6), cytokeratine 14 (CK14), oestrogeenreceptor (ER), P63 eiwit, vimentin (VIM), en α-gladde spier actine (Alpha-SMA) antilichamen werden gebruikt op 29 neoplasmata (3 goedaardige en 3 kwaadaardige myoepitheliale tumoren, 7 carcinomen in goedaardige-gemengde tumoren en 16 complexe carcinomen) en op normaal weefsel van borstklieren. Al deze antilichamen werden ook getest op 3 borstweefsels van dieren zonder borstpathologie. De myoepitheliale merkers werden goed uitgedrukt in de suprabasale cellen en geleidelijk verloren in de motiele types, met de stellate cellen handhaven alleen vim expressie typisch voor mesenchym. ER labelde wat rustgevende en beweeglijke myoepitheliale cellen. Op basis van onze resultaten stellen we een overgang voor van myoepitheliale immotiele cellen naar trekkende fibroblast-achtige cellen. Deze overgang en de karakterisering van een immunohistochemisch panel voor rust en beweeglijke myoepitheliale cellen werpen meer licht op het biologische gedrag van myoepitheliale cellen.

1. Inleiding

borstkliertumoren van honden worden gevormd door zowel epitheliale (epitheel en myoepitheel) als mesenchymale componenten. De oorsprong van de mesenchymcellen wordt nog steeds besproken. De verhoogde frequentie van tumoren tonen myoepitheliale of basale cel proliferatie is een unieke eigenschap van canine borsttumoren .

in de normale borstklier wordt de lumina begrensd door een binnenste laag Gepolariseerde epitheliale cellen die rusten op twee buitenste of basale lagen van epitheliale en myoepitheliale cellen . Zowel basale als myoepitheliale cellen synthetiseren het keldermembraan van kanalen en alveoli en vormen een structurele barrière tussen de luminale epitheliale cellen en het omringende stroma . In kanalen vormen myoepitheliale cellen een bijna continue laag cellen die parallel aan de lange as van de kanalen zijn georiënteerd. Deze laag omringt de luminale epitheliale cellen en scheidt hen van het kelderverdiepingsmembraan en het stroma. In alveoli, zijn de myoepitheliaale cellen discontinu, die een mand-als netwerk rond de alveoli vormen, toestaand sommige Luminal epitheliaale cellen om het kelderverdiepingsmembraan direct te contacteren . Daarom is het myoepitheel niet alleen gelegen in een ideale positie om te communiceren tussen deze twee compartimenten, maar het is ook gepositioneerd om belangrijke regulerende signalen voor het behoud van de normale celstructuur .

Op basis van immunohistochemie vertonen de drie lagen cellen van de normale borstklier verschillende markers: het luminale epitheel wordt geëtiketteerd door CK19, en de basale cellen en myoepitheliale cellen worden gekleurd door CK5/6 en CK14 en p63, Alfa-SMA, en VIM . Myoepitheliale cellen zijn contractiele elementen die een gecombineerde epitheliale en gladde spierimmunoprofile vertonen. De bovengenoemde tellers worden uitgedrukt in het cytoplasma, behalve p63 die een nucleaire teller is . De laag van de myoepitheliaale cel is de enige bron van tumorontstoringsapparaat p63, die beduidend op proliferatie en invasie van geassocieerde tumorcellen wordt geremd . Bovendien worden de basale myoepitheliaale cellen in de normale borstklier af en toe geëtiketteerd door er antilichaam , dat Voor de moleculair-gebaseerde classificatie van canine borsttumoren wordt gebruikt .

verschillende myoepitheliale celmorfologieën kunnen worden herkend in canine complex en gemengde tumoren: rustende en proliferatieve suprabasale myoepitheliale cellen en spindel en stellaat beweeglijke interstitiële myoepitheliale cellen. Suprabasale cellen bevinden zich tussen het kelderverdiepingsmembraan en het luminale epitheel en vertonen afgeplatte as (rustcellen) of veelhoekige morfologieën (proliferatieve cellen). Interstitiële cellen worden vaak gerangschikt in vaste nesten apposed epitheliale elementen of geïsoleerd in het interstitium . Spindel en stellaat myoepitheliale cellen differentiëren naar een meer algemeen contractiel fenotype .

interstitiële myoepitheliale cellen kunnen uiteindelijk fibroblast-achtige cellen worden, met alleen vim-immunoreactiviteit . De myoepitheliale differentiatie kan culmineren in de vorming van verschillende mesenchymale weefsels, met inbegrip van kraakbeen en Bot in canine mammary gemengde tumor.

de acquisitie van typische kenmerken van mesenchymcellen zal waarschijnlijk ontstaan door epitheliaal-mesenchymale overgang (EMT). EMT is een biologisch fenomeen dat een gepolariseerde epitheliale cel toestaat, die normaal met het kelderverdiepingsmembraan via zijn basale oppervlakte in wisselwerking staat, om veelvoudige biochemische veranderingen te ondergaan die het toelaten om de eigenschappen en functies van mesenchymale cellen aan te nemen .

Dit artikel zal zich richten op verschillende aspecten van myoepitheliale cellen en borsttumoren bij honden, in het bijzonder (1) karakterisering van de vier verschillende myoepitheliale celmorfologische types in de normale en neoplastische borstklier met behulp van een panel van antilichamen en (2) de immunohistochemische veranderingen in myoepitheliale cellen van een epitheliaal naar een mesenchymaal fenotype.

2. Materialen en methoden

2.1. Monsters

borstklieren van 29 vrouwelijke honden zijn afkomstig uit de database van de anatomopathologische dienst van de Faculteit Diergeneeskunde van Bologna. De onderwerpen behoorden tot verschillende rassen: mongrel (𝑛=13), duitse herder (𝑛=3), de Poedel (𝑛=3), de Yorkshire Terrier (𝑛=3), Teckel (𝑛=2), Setter (𝑛=1), Wijzer (𝑛=1), Cocker spaniel (𝑛=1), Schnauzer (𝑛=1), en de Siberische Husky (𝑛=1); ze waren allemaal vrouwtjes, met een gemiddelde leeftijd van 9.20±2.28 jaar (gemiddelde ± SD). De tumoren bestonden uit: 3 goedaardige myoepitheliale tumoren, 3 kwaadaardige myoepitheliale tumoren, 7 carcinomen in goedaardige gemengde tumoren en 16 complexe carcinomen (de laatste twee groepen werden onderscheiden door de aanwezigheid van kraakbeen en/of Bot in de gemengde tumoren). Bovendien, 29 monsters van normale borstklieren van dezelfde tumorlijn en 3 borstmonsters van 3 gezonde niet-mammaire tumor dragende vrouwelijke honden werden geëvalueerd.

tumoren werden geclassificeerd volgens Misdorp et al. en Goldschmidt et al. in goedaardige myoepitheliale tumoren: een zeldzaam neoplasma samengesteld uit myoepitheliale cellen gerangschikt in korte bundels gemengd met een extracellulair fibrillair basofiel materiaal; maligne myoepitheliale tumoren: verschillend van de goedaardige variant met meer polymorfe myoepitheliale cellen; complex carcinoom: een carcinoom dat bestaat uit zowel luminale epitheliale als myoepitheliale componenten; carcinoom in goedaardige tumor: een tumor met brandpunten van kwaadaardige epitheliale cellen of verschillende knobbeltjes van dergelijke cellen die samen met mesenchymale cellen voorkomen die kraakbeen en/of bot hebben geproduceerd, mogelijk in combinatie met vezelig weefsel.

2.2. Immunohistochemie

Vier µm dikke secties werden gesneden uit met formaline gefixeerde paraffine ingebedde blokken met representatieve tumormonsters. Immunohistochemie voor de volgende markers werd gedaan op deze weefsels: CK19, ER, CK5 / 6, CK14, VIM, Alpha-SMA, p63.

secties werden van was ontdaan in tolueen en gerehydrateerd. Endogene peroxidase werd geblokkeerd door onderdompeling in 0,3% waterstofperoxide gedurende 20 minuten. Secties werden vervolgens gespoeld in Tris-buffer. De antigeenwinning werd uitgevoerd met citraatbuffer (2,1 g citroenzuurmonohydraat/liter gedestilleerd water), pH 6,0 (met uitzondering van CK5/6 en ER, die EDTA gebruikten, pH 8,0), en verhitting gedurende twee perioden van 5 minuten in een magnetron bij 750 W, gevolgd door afkoeling bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. De primaire antilichamen worden samengevat in Tabel 1. Alle primaire antilichamen werden ‘ s nachts bij 4°C geïncubeerd, gevolgd door een commerciële streptavidine-biotine-peroxidase-techniek (Lsab Kit, Dako, Amsterdam, Nederland). Diaminobenzidine (0,05% gedurende 10 min bij kamertemperatuur) werd gebruikt als chromogeen. De dia ’s werden tegengewerkt met Papanicolaou’ s hematoxyline.

als negatieve controle werd het primaire antilichaam vervangen door een irrelevant, isotype-matched antilichaam voor de controle op niet-specifieke binding van het secundaire antilichaam. Positieve weefselcontroles met behulp van dezelfde IHC-protocollen omvatten honden normale borstklier (anti-CK19,- ER,- CK14,-VIM, Alfa-SMA,-p63 antilichamen) en hondenhuid (anti-CK5/6).

het aantal positieve cellen per marker werd semiquantatief berekend − – = geen gekleurde cellen, ± = minder dan 5% positieve cellen, + = 5-50% positieve cellen, ++ = meer dan 50% positieve cellen. Gevallen werden als positief voor ER beschouwd wanneer nucleaire kleuring werd waargenomen in ten minste 5% tumorcellen .

3. Resultaten

vier typen myoepitheliale cellen werden herkend op basis van hun morfologie. Het rustende subtype vertoonde de langwerpige eigenschappen van spindelcellen in nauw contact met luminale epitheliale cellen evenals prolifererende suprabasale cellen die in plaats daarvan een veelhoekige vorm toonden (figuur 1(a)). De interstitiële beweeglijke cellen werden waargenomen, zowel de vorming van nesten (de spindel type beklede nesten en de stervormige cellen vormden de nestkern) en geïsoleerd in het interstitium (Figuur 2(a)).

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)

Figuur 1

Suprabasal myoepithelial cellen: rust (dunne pijlen) en proliferatieve (dikke pijlen) cellen. Immunohistochemische uitdrukking van een panel van antilichamen toegepast door IHC, 63x (a) Hematoxylin-eosin; (B) anti-ck19 antilichamen die het cytoplasma etiketteren; (C) anti-er antilichamen die de kernen etiketteren; (d) anti-ck 5/6 antilichamen die het cytoplasma etiketteren; (e) anti-ck14 antilichamen die het cytoplasma etiketteren; (f) anti-VIM antilichamen die het cytoplasma etiketteren; (g) Anti-Alpha-SMA antilichamen die het cytoplasmic membraan etiketteren; (h) Anti-p63 antilichamen die de kernen etiketteren.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)

Figure 2

Motile myoepithelial cells: spindle (asterisks) and stellate (stars) cells. Immunohistochemical expression of a panel of antibodies applied by IHC. 63x (a) Hematoxylin-eosin; (b) anti-CK19 antibodies labeling the cytoplasm; (c) anti-ER antibodies labeling the nuclei; (d) anti-CK 5/6 antibodies labeling the cytoplasm; (e) anti-CK14 antibodies labeling the cytoplasm; (f) anti-VIM antilichamen die het cytoplasma etiketteren; (g) Anti-Alpha-SMA antilichamen die het cytoplasmic membraan etiketteren; (h) Anti-p63 antilichamen die de kernen etiketteren.

3.1. Normale borstklier

in de 3 controlegevallen werden alle rust-en proliferatieve suprabasale myoepitheliale cellen gelabeld met p63, CK14, Alfa-SMA en VIM. In geen van de gevallen werd CK19 tot expressie gebracht door rustgevende en proliferatieve suprabasale myoepitheliale cellen.

3.2. Borstweefsel uit dezelfde lijn van de borsttumor

In de 29 normale weefsels in dezelfde lijn als de tumoren werden alle rust-en proliferatieve suprabasale myoepitheliale cellen gelabeld met p63, Ck14, Alfa-SMA en VIM. CK5 / 6 was positief in alle gevallen op vier na en ER werd gedetecteerd in 12 gevallen. Ck19-expressie werd alleen waargenomen in het luminale epitheel. Myoepitheliale beweeglijke interstitiële cellen werden niet waargenomen. Alle resultaten zijn samengevat in Tabel 2.

3.3. Borsttumoren

immunohistochemische resultaten voor suprabasale (figuur 1) en beweeglijke cellen (Figuur 2) met behulp van p63, CK14, CK5/6, CK19, Alfa-SMA, VIM en ER zijn samengevat in Tabel 2. CK5 / 6 gelabeld: suprabasale rustcellen in 16 van de 29 gevallen (5 carcinomen in goedaardige gemengde tumoren en 11 complexe carcinomen). CK 5/6 labelde ook proliferatieve suprabasale en spindel motiele cellen in 10 gevallen (3 carcinomen in goedaardige gemengde tumoren en 7 complexe carcinomen). Stellaatmotiele cellen waren aanwezig in 25 gevallen (1 goedaardige myoepitheliale tumor, 3 kwaadaardige myoepitheliale tumoren, 5 carcinomen in goedaardige gemengde tumoren en 15 complexe carcinomen) maar waren negatief voor CK5/6. Kraakbeen in de borst gemengde tumoren was altijd negatief.

CK14 toonde positiviteit in 23 gevallen in rustende cellen (met uitzondering van 1 complex carcinoom en benigne en maligne myoepithelial tumoren), in 22 gevallen in proliferatieve cellen (6 carcinomen in goedaardige gemengde tumoren en complexe 15 carcinomen) met een trend tot het verlies van de expressie wanneer deze cellen had verworven, de meer beweeglijke fenotype van de spil cellen (positief in 2 goedaardige en 3 maligne myoepithelial tumoren, 2 carcinomen in goedaardige gemengde tumoren en 2 complexe carcinomen). Chondrocyten van gemengde tumoren waren negatief.

VIM was positief in suprabasale cellen in de 23 gevallen van carcinoom in benigne tumor en complex carcinoom en in beweeglijke myoepitheliale cellen in alle 29 gevallen. Stromale cellen waren positief in alle gevallen. Kraakbeen was VIM positief bij alle 7 carcinomen in goedaardige-gemengde tumoren.

Alfa-SMA gelabeld rust – en proliferatieve suprabasale myoepitheliale cellen in 23 carcinomen in goedaardige gemengde tumoren en complexe carcinomen. De spindelcellen in 10 gevallen (5 carcinomen in goedaardige gemengde tumor en 5 complexe carcinomen) toonden positiviteit voor Alfa-SMA. In elk geval, op twee complexe carcinomen na, waren stellaatcellen negatief. Stroma vertoonde positiviteit in slechts 6 gevallen (1 carcinoom in goedaardige gemengde tumor en 5 complexe carcinomen).

P63 werd gedetecteerd in rust – en proliferatieve suprabasale myoepitheliale cellen van de 23 gevallen van carcinoom in goedaardig-gemengd tumor-en complexcarcinoom. Alle spindel-en stellaatcellen waren negatief. Stromale cellen en kraakbeen waren negatief.

er expressie was aanwezig in 11 suprabasale myoepitheliale cellen (4 carcinomen in goedaardige gemengde tumoren en 7 complexe carcinomen); spindel-en stellaatmotiele cellen waren positief in 9 gevallen (3 carcinomen in goedaardige-gemengde tumoren en 6 complexe carcinomen). Kraakbeen van gemengde tumoren was negatief.

rust – en proliferatieve suprabasale en spindel/stellaatmotiele myoepitheliale cellen vertoonden in geen van de onderzochte tumoren ck19. Kraakbeen van gemengde tumoren was ook negatief voor CK19.

4. Discussie

gebaseerd op de bevindingen van Gama et al. en Tateyama et al. , zijn vier morfologische types van myoepitheliaale cellen aanwezig in de borstklier: rustende en proliferatieve suprabasale myoepitheliale cellen die alveoli en kanalen en spindel en stervormige interstitiële beweeglijke cellen, die liggen in de interstitiële ruimte waar ze kunnen worden gerangschikt in nesten. Myoepitheliale tellers, zoals p63, CK5/6, CK14, Alpha — SMA, en VIM, bleken waardevolle kenmerkende toevoegingen te zijn om de evaluatie van complexe en gemengde proliferations te vergemakkelijken. CK19 wordt beschouwd als de gouden standaardteller voor luminaal epitheel en werd gebruikt om een verkeerde diagnose met myoepitheliale cellen te voorkomen. Vanwege kruisreactiviteit patronen en het feit dat lesional foci zijn typisch minuscule, geen van de myoepitheliale markers genoten 100% gevoeligheid en specificiteit voor myoepitheliale cellen. Als zodanig moeten ten minste 2 markers worden gebruikt om een bepaalde focus te evalueren .

Op basis van onze resultaten was p63 de beste marker voor suprabasale cellen, vooral in combinatie met CK14, dat beperkt was tot volwassen (basale) myoepitheliale cellen en in mindere mate gevolgd door CK5/6, Alfa-SMA en VIM (figuur 1). Nochtans, markeerde CK5 / 6 ook luminale epitheliaale cellen die het moeilijk maken om hen van proliferative suprabasal myoepitheliaale cellen te onderscheiden . Morfologisch kunnen zowel epitheliale als myoepitheliale cellen een veelhoekige vorm hebben. Een kenmerk van zowel CK14 als CK5/6, maar niet van p63, Alfa-SMA en VIM, was hun verminderde expressie in myoepitheliale cellen in de suprabasale proliferatieve toestand. De uitdrukking ck14, CK5 / 6, en p63 werd geleidelijk verloren in cellen in de spindel en stellate motile staat.

Alfa-SMA en VIM waren aanwezig in spindelmotiele myoepitheliale cellen met verschillende intensiteitsgraden. Alleen VIM bleek een consistente marker te zijn voor stellaatmotiele myoepitheliale cellen. In deze studie werd het stellaatmotiel myoepitheel gerangschikt in nesten en bekleed door rustcellen vermoedelijk van alveolaire oorsprong. Deze eigenschap kan het idee ondersteunen dat de nesten van stellate motile myoepithelial cellen, die uitdrukking van de belangrijkste myoepithelial suprabasal tellers hebben verloren, maar affiniteit voor VIM behouden, de voorlopers van kraakbeen zijn, die erop wijzen dat deze cellen hun transformatie in mesenchymal elementen hebben voltooid. In goedaardige en kwaadaardige myoepitheliale tumoren, vim-etikettering in alle gevallen, verlies van alle andere suprabasale myoepitheliale markers, en de schaarse positiviteit aan CK14 in spindelcellen waren indicatief voor een heersende expressie van de myoepithelium motiele toestand en een mogelijke overgang van eenvoudige myoepitheliale cellen naar mesenchymale fibroblasten.

in onze studie werd het bewijs van de verschuiving van de myoepitheliale cellen naar een mesenchymaal fenotype, aangetoond door het verlies van ck14, CK5/6 en p63 expressie, versterkt door de discontinue etikettering van spindelcellen voor Alfa-SMA, een marker van zowel myoepitheliale cellen als myofibroblasten, die volledig verloren ging in stellaatmotiele cellen die zogenaamd fibroblasten zijn geworden.

verdere bevestigingsstudies door Tsuda et al. meldde het optreden van myofibroblasten met restanten van ck14-expressie (beschreven als “geconverteerde myoepitheliale cellen”). In de in dit onderzoek onderzochte gevallen vervaagde CK14 geleidelijk, hetgeen wijst op een verlies van het (myo-)epitheliale fenotype. Deze resultaten ondersteunen de EMT hypothese waarbij een myoepitheliale-achtige toestand , die een myoepitheliale mesenchymale overgang (MMT) ondergaat. Deze hypothese werd bevestigd in de hond door Gärtner et al. die verklaarde dat in borsttumoren één van de stappen in de evolutie van mesenchymal cellen de uitdrukking van typische myoepithelial eigenschappen impliceert.

een interessant resultaat van deze studie was de positiviteit voor ER gevonden in 12/29 suprabasale myoepitheliale cellen en 9/29 stellaatcellen van carcinoom in goedaardige gemengde tumoren en complexe carcinomen. Er zijn twee isovormen van ER-receptoren beschreven, namelijk ER-α en ER-β, waarvan de laatste de enige vorm is die tot uiting komt in de kernen van geïsoleerde basaal-myoepitheliale cellen . Het in dit onderzoek gebruikte antilichaam omvatte beide isovormen: zowel luminale als basale / stellaatcellen werden geëtiketteerd, vermoedelijk luminale cellen door ER-α en basale/stellaatcellen door ER-β.

concluderend werden de suprabasale myoepitheliale cellen goed gekarakteriseerd door p63 en CK14 en in mindere mate door de andere gebruikte marker. De beweeglijke myoepitheliale cellen worden in plaats daarvan gekenmerkt door Alfa-SMA en VIM en verlies van CK14, CK5 / 6, en p63 (Figuur 2). De huidige studie toonde ook ER aan in zowel luminale epitheliale als suprabasale/stellaat myoepitheliale cellen (de laatste in ongeveer de helft van de gevallen) en dat ER expressie niet wordt beïnvloed door de rust/beweeglijke fase. Daarom, in seriële of multistained secties, kan immunohistochemie aan ER in combinatie met p63 en CK14 dienen om onjuiste identificatie van luminale of myoepitheliale cellen in canine borsttumoren te vermijden. De trend van behouden Alfa-SMA en VIM expressie in spindelcellen, en alleen vim positiviteit in stellaat motiele cellen evenals de verminderde P63 expressie in beide motiele types, ondersteunt de hypothese van de EMT waarbij een myoepitheliaal-achtige toestand in MMT. De beweeglijke spindelcel kan worden beschouwd als een vroegere transformatie dan de stellaatcel naar een mesenchymaal fenotype.

bijdrage van de auteurs

deze auteurs droegen in gelijke mate bij aan dit werk.

belangenconflict

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen te hebben.

dankwoord

De auteurs danken mevrouw Anne Collins voor het bewerken van de Engelse tekst.

aanvullend materiaal