Ekstracellulær matriks forberedelse og reologi

ECM består av et nettverk av gelatin og fibrin. FOR å forberede ECM-komponentene produseres en 15 wt/v% gelatinløsning (type A, 300 bloom fra porcine skin, Sigma) først ved å tilsette gelatinpulver til en varm oppløsning (70 °C) AV DPBS (1x Dulbelcos fosfatbufret saltvann uten kalsium og magnesium). Gelatinen kan oppløses fullstendig ved omrøring i 12 timer ved 70 °C, og pH justeres deretter til 7,5 ved Bruk Av 1 M NaOH. Oppløsningen er steril filtrert og lagret ved 4 °C i alikvoter for senere bruk i støping (<3 måneder). En fibrinogenoppløsning (50 mg / mL) produseres ved oppløsning av lyofilisert bovint blodplasma protein (Millipore) ved 37 °C i sterile DPBER uten kalsium og magnesium. Løsningen holdes på 37 °C uten omrøring i minst 45 min for å tillate fullstendig oppløsning. Transglutaminase (TG) – oppløsningen (60 mg / mL) fremstilles ved oppløsning av lyofilisert pulver (Moo Gloo) i DPBS uten kalsium og magnesium og blandes forsiktig i 20 sek. oppløsningen holdes deretter ved 37 °C i 20 min og steril filtreres før bruk. En cacl2 lager løsning (250 mM) fremstilles ved å oppløse CaCl2 pulver i DPBS uten kalsium og magnesium (Corning). For å tilberede stamoppløsning av trombin rekonstitueres lyofilisert trombin (Sigma Aldrich) ved 500 E/mL ved bruk av sterile DPBER og oppbevares ved -20 °C. Trombin alikvoter tines umiddelbart før bruk.

en kontrollert stress rheometer (DHR-3, Ta Instrumenter, New Castle, DE) med en 40 mm diameter, 2° kjegle og plate geometri brukes for blekk reologi målinger. Skjærlagringsmodulene (G’) og tap (G») måles med en frekvens på 1 Hz og en oscillatorisk belastning (γ) på 0,01. Tids feier utføres ved raskt å plassere en ferdigblandet ECM-løsning som inneholder trombin på Peltier-platen holdt ved 37 °C.

Blekkformuleringer

To blekk er nødvendig FOR 3d bioprinting av perfusable PT-modeller. En blekk, som brukes til å lage perfusjonsbrikkpakningen, består av en todelt silikonelastomer (SE 1700, Dow Chemical) med en 10:1 base til katalysator (etter vekt) som homogeniseres ved hjelp av en sentrifugalblander i 2 min (2000 rpm, AE-310, Thinky Corp, Japan). Silikonblekket skrives ut innen 2 timer etter blanding med katalysator. Dette blekket legges i en sprøyte (EFD Inc., East Providence, RI) og sentrifugert for å fjerne eventuelle luftbobler før utskrift ved romtemperatur. Den andre blekk, en flyktende blekk som brukes til å skrive ut tubuli, består av 38 wt% Pluronisk F127(Sigma) Og 100 E / mL trombin i deionisert, ultrafiltrert (DIUF) vann. Fugitive blekk er farget rosa gjennom tillegg Av En Risiko Reaktor fargestoff for visualisering I Fig. 1 Og Film S1. For å forberede dette blekket homogeniseres en 40 wt% Pluronisk F127-løsning i vann ved hjelp Av En Thinky-mikser til pulveret er fullstendig oppløst, og deretter lagret ved 4 °C. før bruk tilsettes en 2000 E/mL trombinoppløsning til den flyktige (Pluroniske) blekk i et forhold på 1:20, og homogeniseres ved Hjelp av En Thinky-mikser. Fugitive blekk lastes deretter i en sprøyte (EFD Inc., East Providence, RI) til 4 °C og sentrifugert for å fjerne eventuelle luftbobler. Før utskrift, er denne blekk likevekt ved romtemperatur i minst 15 min.

Bioprinting av perfusable 3d proksimale tubule constructs

3D PT constructs er fabrikkert ved hjelp av en spesialdesignet, multimaterial 3d bioprinter utstyrt med fire uavhengig adresserbare skrivehoder montert på en 3-akse, bevegelseskontrollert portalgang med et byggevolum på 725 mm × 650 mm × 125 mm (AGB 10000, Aerotech Inc ., Oslo, norway). Blekk er plassert i separate sprøytefat hvor dyser av varierende størrelse (dvs. 50 µ-410 µ diameter) er festet via en luer-lås (EFD Inc., East Providence, RI, USA). Blekk ekstruderes gjennom avsetningsdyser ved å påføre lufttrykk (800 Ultra dispensing system, EFD Inc., East Providence, RI, USA), som varierer fra 10-90 psi, tilsvarende utskriftshastigheter mellom 1 mm / s og 5 cm / s. vi skriver først ut den tilpassede perfusjonsbrikkpakningen ved å sette silikonblekket gjennom en konisk 410 µ dyse på 50 mm × 75 mm glassglass. Pakningsdesignet er opprettet ved hjelp AV et tilpasset MATLAB-skript som genererer G-kode for en endelig pakningsstruktur. Etter utskrift herdes perfusjonsbrikkepakningen ved 80 °C i en ovn for > 1 time og lagres ved romtemperatur før bruk.

Mønster 3D PTs i perfusjonsbrikken krever en kombinasjon av å støpe ECM og skrive ut flyktig blekk. FØRST OPPRETTES ECM-løsningen ved å kombinere 10 mg / mL fibrinogen, 7,5 wt% gelatin, 2,5 mM CaCl2 og 0,2 wt% TG. Denne løsningen blir deretter equilibrated ved 37 °C i 15-20 min før bruk for å forbedre optisk klarhet I ECM25. Deretter blandes løsningen raskt med trombin i et forhold på 500:1, noe som resulterer i en endelig trombinkonsentrasjon på 1 U/mL. Innen 2 minutter ved 37 °C oppstår polymerisering av fibrinogen i fibringel. AV denne grunn må ECM-oppløsningen støpes på basen av perfusjonsbrikken umiddelbart etter blanding med trombin. Basen ECM-laget får da tørke litt under nitrogen, slik at det danner en flat overflate. Det flyktige Pluroniske f127-blekket (med 100 E/mL trombin) er trykt PÅ ECM-laget i FORM AV et innviklet filmament (tubule) ved hjelp av en konisk 200 µ dyse. En tilpasset Python script (MeCode) brukes til å angi toolpath I G-kode. Direkte etter flyktig blekkutskrift, blir metallhule perfusjonspinner som er forbundet gjennom silikonpakningen, tatt i kontakt med det trykte blekket. Et topplag AV ECM dannes da ved å støpe ECM-løsningen over det trykte rør, som beskrevet ovenfor, til innenfor 1-2 mm av høyden på pakningsveggene. Hvis celler, For eksempel HNDFs, er innlemmet I ECM (Fig. S5), blandes de inn direkte etter likevektsperioden, før trombinblanding og påfølgende støping. Etter at DET ØVERSTE ECM-laget er støpt, er konstruksjonen dekket med et glassglass for å forhindre fordampning eller forurensning og holdes ved 37 °C i 1 h for å tillate fibrinpolymerisering å avslutte og TG for å krysse nettverket. Konstruksjonen blir deretter avkjølt til 4 °C i 15-20 min for å væske det trykte flyktige blekket, som spyles ut av enheten ved hjelp av kaldcellemedier, og etterlater åpne ledninger som tjener som ønsket rørformet nettverk innebygd i ECM med eller uten celler i det ekstratubulære ECM-rommet.

Ved hjelp av denne metoden produserte VI OGSÅ 3d-arkitekturer i en lag-for-lag-byggesekvens. For eksempel er hvert enkelt lag av trelagsstrukturen vist i Fig. S10 er konstruert ved hjelp av en modifisert utskriftsprotokoll som inkorporerer materialene og metodene som tidligere ble diskutert. Etter utskrift av de første tubulene med fugitive ink, støpes ET LAG MED ECM over utskriften og tillates 20 min til gel ved 37 °C før neste proksimale tubulelag skrives ut med fugitive ink på toppen av det nylig gelerte laget. Denne suksessive konstruksjonen introduserer 3d-geometri og tillater vellykket evakuering av alle kanaler uavhengig etter bygging. Vandig-baserte risiko reaktor fargestoffer er perfused gjennom kanalene OG begeistret MED UV-lys for visualisering.

for å fullføre 3d tissue chip monteringsprosessen, er HVER PT konstruksjon plassert på en maskinert rustfritt stål base og en tykk akryl lokk er plassert på toppen. Lokket og basen klemmes sammen med fire skruer, og danner en tetning rundt den trykte silikonpakningen. Deretter fylles sterilt to-trinns peristaltisk rør (PharMed BPT, 0,25 mm innvendig diameter) med media og kobles til utløpet av et sterilt filter som er festet til EN 10 ml sprøytefat (EFD Nordson), som fungerer som et mediereservoar. PTEC media (designet for vekst, SÅ ATCC formulering pluss 1% FBS, 1% aprotinin, og 1% anti-anti) som har vært equilibrating for >3 h i en inkubator på 37 °C, 5% CO2 er lagt til media reservoaret, og rør fra reservoaret er koblet til utløpet av chip (metall hul perfusjon pin). En sprøyte brukes da til å utøve lite trykk på mediet i fatet, og tvinger det til å gå inn og fylle den vedlagte slangen helt. Fylling av slangen med media før du kobler den til kretsen, forhindrer innføring av luftbobler i systemet. For å fullføre perfusjonskretsen er silikonrør fra reservoaret koblet til innløpsmetallperfusjonspinnen på brikken. Slangeklemmer legges til ved innløpet og utløpet av perfusjonsbrikken for å forhindre ukontrollert strømning når den kobles fra peristaltisk pumpe, noe som kan skade epitelet eller tillate luftbobler å komme inn i systemet. Mediereservoaret balanseres til enhver tid med atmosfæriske forhold i inkubatoren ved hjelp av et sterilt filter på toppen av mediereservoaret.

Cellekultur

human immortalized PTECs (RPTEC / TERT1, ATCC CRL-4031) er dyrket per ATCCS instruksjoner og brukes til ALLE PT-modellstudier opp til passasje 20. For genuttrykksanalyse brukes og dyrkes humane primære rptec (Cell Science), immortalized PTECs (RPTEC-TERT1, Evercyte) og A498 (ATCC HTB-44) nyrekreftceller i henhold til leverandørens instruksjoner. Human neonatal dermal fibroblaster (HNDF), gfp expressing (Angio-Proteomie) dyrkes etter leverandørens instruksjoner og brukes opp til passasje 15.

gene expression analysis

human primary rptec (Cell Science), immortalized RPTEC-TERT1 (Evercyte) Og A498 (ATCC HTB-44) nyrekreftceller dyrkes i 96-brønnplater i henhold til leverandørens instruksjoner og samles på dag 3 etter konfluens ved å erstatte kulturmedium med 100 µ / brønn med 1X RNA lysisblanding (Quantigen Sample Processing Kit, QS0101). Deretter blandes 40 µ lysat med et mrna-fangstmagnetisk perlesett (Panomics Quantigen Plex Set 12631, katalognummer 312631), inkuberes over natten, bearbeides for forgrenet DNA-forsterkning og analyseres i henhold til produsentens anvisninger (Panomics Quantigen Plex Assay kit, QP1015). Ppib-sonden brukes som et husholdningsgen for normalisering. Fluorescensintensitet (FI) data presenteres som gjennomsnitt og standardavvik av 3 biologiske replikater.

Cytokinanalyse av medieperfusat

Medieperfusat hentes fra et tubuli over en periode på 25 dager etter cellesåing og lagres ved -80 °C før analyse. For cytokinprofilering tines supernatanter på is, fortynnes 2x i prøvefortynningsbuffer (biorad-katalog #M60-009rdpd) og analyseres Av Luminex teknologibasert ELISA ved Bruk Av Bio-Plex Pro™ Humant Kjemokin IL-6 (Sett #171bk29mr2), IL-8 (Sett #171-BK31MR2) OG MCP-1 (Sett #171-BK36MR2) og Bio-Plex 200-Systemene (biorad) i henhold til produsentens instruksjoner. Data rapporteres som gjennomsnittlige cytokinkonsentrasjoner og standardavvik fra tekniske triplikater.

Epithelialization og longitudinell kultur

Hver 3D PT konstruksjon er perfusert i flere timer MED PTEC media i inkubatoren før celle lasting/seeding. PTECs (PTEC / TERT1, ATCC) er trypsinisert fra deres kulturrett og konsentrert i media til ~2 × 107 celler/mL. Cellesuspensjonen lastes deretter inn i perfusjonsbrikken gjennom utløpet (Fig. S3b, c). Den lastede konstruksjonen plasseres lateralt i inkubatoren i flere timer og vendes 180° i løpet av flere halvtimes intervaller for å tillate jevn såing av tubuleveggene, og inkuberes deretter i tubulen uten strømning over natten. Neste dag spyles ikke-adherente celler ut av tubulen under flyt av tyngdekraften. Perfusjon av friske medier startes deretter og de gjenværende cellene begynner å klynge og deretter vokse fra disse koloniene (Fig. S3f) til de når sammenløp rundt 3 uker etter sådd (Fig. S3k). Under vekstfasen blir PTECs matet PTEC media utarbeidet per atcc-retningslinjer pluss 1% Aprotinin (EMD Millipore, som brukes til å redusere nedbrytningen AV ECM), 1% føtal bovint serum (FBS) og 1% antibiotika-antimykotisk (Gibco). ETTER modning fjernes FBS, Og PTECs pakkes inn i et tett epitelmonolag (Film S2). Ved dag 1 etter sådd blir PTECs utsatt for kontinuerlig, ensrettet strømning ved 1 µ / min, tilsvarende skjærspenninger som varierer mellom 0,1 og 0,5 dyn/cm2 avhengig av tubuletverrsnittet. Media mates via en peristaltisk pumpe i en lukket sløyfekrets og skiftes hver 2. dag.

Albumin opptak studie

Albumin opptak er vurdert for de trykte 3D PT modeller samt 2d kontroller. Den første kontrollen består Av PTECs vokst på vev kultur plast, mens den andre kontrollen består Av PTECs vokst på VÅR ECM. I hvert tilfelle vokser PTECs til sammenløp og får lov til å modnes i serumfrie medier. Humant serumalbumin konjugert MED FITC (HSA-FITC, Abcam ab8030) er suspendert i PTEC media ved 50 µ/mL. Alle prøver inkuberes MED HSA-FITC i deres media for 2 h (i tilfelle perfusjon blir den perfusert gjennom det åpne lumen). Etter eksponering vaskes alle prøver med 3x volum og deretter trypsinisert med 10x trypsin for å samle de enkelte cellene. Celler er faste og counterstained med primære og sekundære antistoffer for megalin (Tabell S2 viser de spesifikke antistoffene som brukes). Celler fra disse prøvene, og nakne celler, analyseres ved flowcytometri (BD Lsr Fortessa) og data samles inn fra n = 10.000 celler per prøve. For å få bilder AV HSA-FITC og megalin I PTECs, blir prøvene festet på plass med formalin i stedet for å bli trysinisert etter vasketrinnet. Disse prøvene er counterstained for megalin og avbildet ved hjelp av konfokal mikroskopi (Zeiss LSM710).

Ciklosporin a testing

Effekten Av Cisa på BÅDE 2d kontroller og bioprinted 3D PTs er undersøkt. I 2D blir celler sådd i et 96-brønnformat på vevskulturplast og vokst til sammenløp. De er fed media per atccs retningslinjer. Cisa (Sigma-Aldrich, SML1018) er suspendert i sine medier ved forskjellige konsentrasjoner og inkubert med celler for 24 h. en levedyktighetsanalyse ved bruk av(3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-5-(3-karboksymetoksyfenyl)-2-(4-sulfofenyl)-2h-tetrazolium) i nærvær av fenazinmetosulfat (MTS) kjøres ved 24 h-merket etter eksponering. Denne analysen er fullført På PTECs ved tidlig confluency, ved å gi Cisa til cellene den dagen de nådde confluency, samt sen confluency, ved å gi Cisa flere dager etter at de nådde confluency. Spesielt er toksisitetsresultatene like for hvert tilfelle(Fig. 5n). For 3D PTs blir Cisa matet i forskjellige konsentrasjoner gjennom det åpne lumen av modne tubuli etter å ha nådd konfluens (ved ~3 ukers mark), hvor ingen serum er inkludert i media i minst 10 dager. Ved 24 h-merket etter Cisa-eksponering utføres EN FITC-dextran lekkasjetest (beskrevet nedenfor) for å vurdere og kvantifisere forstyrrelser til Barrierefunksjonen Til PTECs. DIREKTE etter ER PT festet ved hjelp av 10% bufret formalin for 1 h og counterstained for actin og DAPI (Tabell S2 viser de spesifikke flekkene som brukes).

diffusjonspermeabilitetsmålinger

for å vurdere barrierefunksjonen til epitelet I 3D, kvantifiseres diffusjonspermeabilitet ved å perfusere PTEC-medier i det åpne lumen som inneholder 25 µg / mL FITC-KONJUGERT 70 kDa dekstran (FITC-Dex, Sigma-produkt 46945) med en hastighet på 15 µL / min i 3 min og 1 µ/min deretter i ~30-45 min. Hele testen utføres under levende celleavbildning med både tubule og den omkringliggende ECM i synsfeltet (Fig. S9). Diffusjonsmønsteret TIL FITC-Dex oppdages ved hjelp av et bredt felt fluorescerende mikroskop (Zeiss Axiovert 40 CFL). Fluorescens bilder er tatt før perfusjon og hver 3 til 5 min over en 30-45 min periode. Diffusional permeabilitet AV FITC-DEX beregnes ved å kvantifisere endringer i fluorescens intensitet over tid ved hjelp av følgende equation34;

Pd er diffusjons permeabilitet koeffisient, I1 er gjennomsnittlig intensitet på et innledende tidspunkt, I2 er en gjennomsnittlig intensitet på t ~ 30-45 min, Ib er bakgrunnsintensitet (bilde tatt før perfusjon av fitc-dex), Og D er diameteren på kanalen. Andre forskere har rapportert At PTECs kan resorb dextran39, noe som vil føre til litt høyere verdier for den målte diffusjonspermeabiliteten.

vi undersøkte også barriereegenskapene til våre epitelforede tubuli ved hjelp av en lavmolekylær forbindelse, inulin (4,5 kDa) som ikke er resorbert eller utskilt in vivo av PTECs ved hjelp av samme metode beskrevet ovenfor. Spesielt oppløses inulin-FITC (Sigma-produkt F3272) i oppvarmede PTEC-medier ved 100 µ/mL og perfiseres i det åpne lumen med en hastighet på 20 µ/min i 3 minutter og deretter 1,5 µ/min i ~15 minutter. Hele testen utføres under levende celleavbildning med både tubule og den omkringliggende ECM i synsfeltet (Fig. S7). Diffusjonsmønsteret AV FITC-inulin oppdages ved hjelp Av Et bredt felt fluorescerende mikroskop (Leica). Fluorescens bilder er tatt med en gated lyskilde og bevegelse kontrollert scenen før perfusjon og hver 3 til 5 min over 15 min periode for å samle tekniske triplikat målinger.

Elektronmikroskopi

for transmisjonselektronmikroskopi (TEM), PTECs I 2D eller 3d-arkitekturer eller sunt humant nyrevev oppnådd fra en standardbiopsi før transplantasjon er løst ved hjelp av 2,5% glutaraldehyd, 1,25% paraformaldehyd og 0,03% pikrinsyre i 0,1 m natriumkacodylatbuffer (pH 7,4) i minst flere timer. Små prøver (1 mm × 1 mm) fjernes og vaskes i 0,1 M cacodylatbuffer og badet i 1% osmiumtetroksid (OsO4) (EMS) og 1.5% kaliumferrocyanid (KFeCN6) (Sigma) i 1 time, vasket i vann 3x og inkubert i 1% vandig uranylacetat (EMS) i 1 time etterfulgt av 2 vasker i vann og påfølgende dehydrering i varierende grad av alkohol (10 min hver; 50%, 70%, 90%, 2 × 10 min 100%). Prøvene settes deretter i propylenoksid (EMS) i 1 time og inkuberes over natten i en 1:1 blanding av propylenoksid Og TAAB Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, Canada). Dagen etter er prøvene innebygd I TAAB Epon og polymerisert ved 60 °C i 48 timer. 60 nm) er kuttet på Et Reichert Ultracut – s mikrotom, plassert på kobbergitter farget med blysitrat og undersøkt I ET JEOL 1200EX Transmisjonselektronmikroskop og bilder registreres med ET AMT 2K CCD-kamera. Bildeanalyse utføres ved Hjelp Av ImageJ programvare.

for scanning elektronmikroskopi (SEM), perfused PTECs I 3D er løst ved hjelp av 10% bufret formalin for 1 h. prøvene er tynt skiver (~1 mm tykk) for å eksponere celler omskrive åpne lumen. Fikseringsmiddel vaskes bort Ved Hjelp Av PBSx2 og påfølgende dehydrering i varierende grad av etanol (20 min hver; 30%, 50%, 70%, 90%, 3 × 20 min 100%). Prøvene blir deretter plassert i 50% etanol og 50% heksametyldisilazan (HMDS) i 30 min etterfulgt av 100% HMDS 3 × 30 min. Alle trinn utføres i en lukket og forseglet glassbeholder. ETTER den endelige vasken med HMDS fjernes prøvene og plasseres i en åpen beholder under N2 i avtrekksdekselet for å tørke. Tørkede prøver er montert på aluminium pin mounts ved hjelp av ledende karbon tape, sputter belagt med gull, og avbildet med En Tescan Vega Sem.

Immunostaining

Immunostaining etterfulgt av konfokal mikroskopi brukes til å vurdere cellulær lokalisering av proteiner I 2d-og 3D-PTEC-modeller. Før immunostaining vaskes hver konstruksjon med PBS og festes deretter i 20 min til 1 time ved bruk av 10% bufret formalin. Fikseringsmiddel fjernes ved hjelp av flere vasker I PBS i flere timer og deretter blokkert over natten ved hjelp av 1 wt% bovint serumalbumin (BSA) I PBS. Primære antistoffer mot celleproteinet eller biomarkøren av interesse inkuberes med konstruksjonene i 1 dag ved fortynningene oppført i Tabell S2 i en oppløsning på 0,5 wt% BSA og 0,125 wt% Triton X-100. Fjerning av ubundne primære antistoffer oppnås ved bruk av et vasketrinn mot en løsning AV PBS eller 0,5 wt% BSA og 0,125 wt% Triton X-100 I PBS i 1 dag. Sekundære antistoffer inkuberes med konstruksjonene i 1 dag ved fortynningene oppført i Tabell S2 i en oppløsning på 0,5 wt% BSA og 0,125 wt% Triton X-100 I PBS. Prøver er motfarget Med NucBlue eller ActinGreen i 2 timer og vaskes deretter i 1 dag i PBS før avbildning.

bildegjengivelse og analyse

Fasekontraktmikroskopi utføres ved hjelp Av et invertert Leica DM IL-omfang med mål fra 1,25 x TIL 40X. Konfokal mikroskopi utføres ved hjelp Av en Oppreist Zeiss Lsm 710 Med nedsenkningsmål fra 5x TIL 40X ved bruk av spektrale lasere ved 405, 488, 514, 561 og 633 nm bølgelengder. Bilde rekonstruksjoner av z-stabler utføres I ImageJ ved hjelp av z-projeksjon funksjon med maksimal piksel intensitet innstilling. Eventuelle økninger i lysstyrke utføres jevnt over et helt z-projisert bilde. 3d-bilde rekonstruksjoner og roterende filmer (Movie S3) utføres Ved Hjelp Av Imaris programvare. Den nye CytoSMART (Lonza) i inkubatorsystemet brukes til å fange time-lapse imaging (Movie S2). Bildeanalyse for kvantifisering av diffusjons permeabilitet utføres ved hjelp av tilpassede MATLAB-skript som bruker tidligere rapporterte metoder34. TEM – bildeanalyse utføres med ImageJ-programvare for å måle cellehøyde (n ≥ 50), mikrovilli-tetthet (n ≥ 25) og mikrovilli-lengde (n ≥ 150) over minst 3 uavhengige prøver for hver tilstand.

Statistisk analyse

Data er uttrykt som betyr ± standardavvik. Statistisk analyse utføres VED BRUK AV MATLAB og statistisk signifikans bestemmes til en verdi av p < 0,05 som bestemt av EN ANOVA ved Bruk Av Tukeys multiple parvis sammenligningstest. Ulike signifikansnivåer (p-verdier) er angitt med stjerner og spesifikke p-verdier er gitt i hver figurlegende.