Resultater

vi studerte villtype (WT), heterozygot V2RV31R/WT og homozygot V2R31R/V2R31R mus. De mutante musene hadde normale tall og frekvenser av modne mil αβ t-Celler og tymocytter i hvert utviklingsstadium. På grunn av mangel på kongeniske markører kan ikke tcrß proteiner identifiseres av allelet som koder for dem, og heller ikke om De inkluderer Cß 1 versus Cß 2 regioner. Derfor utførte vi flowcytometri med anti-V2 og anti-V31 antistoffer for å kvantifisere celler som uttrykker v2+ og V31 + tcrß proteiner. VI analyserte CD4 + og CD8+ single-positive (SP) thymocytter da de er modne og naive αβ t-Celler. Reflekterende publiserte data (8, 9), oppdaget vi en liten brøkdel (0,11%) av celler som farget med begge antistoffene I WT-mus(Fig . 1 B og C), som er i samsvar med en liten populasjon Av v2+V31+ αβ t-Celler. Vi observerte en 12,4 ganger økt fraksjon av disse cellene I V2R31R / WT-mus, og en 32,8 ganger økning I v2r31r / V2R31R-mus (Fig. 1 B og C). Disse forhøyede frekvensene av dual-TCRß + celler korresponderte med større utnyttelse Av V2 og V31 i uttrykte tcrß kjeder (Fig. 1 D-F). Disse dataene viser at forbedring AV RSS-kvaliteten på to Vß på samme allel øker omleggingen og dermed brøkdelen Av T-celler som uttrykker to forskjellige typer tcrß proteiner. Siden Vß-repertoaret til SP-thymocytter gjenspeiler de relative nivåene som individuelle vß-segmenter rekombinerer (10), viser preferansebruken Av V31 over V2 at V31R utkonkurrerer V2R for omlegging. Dette kan skyldes større tilgjengelighet til V31 (11) eller interaksjon mellom V31 og Dß–Jß segmenter før sammentrekning av Sidene I TCRß Steder V2 nær Segmentene I Dß. Spesielt innebærer en høyere enn todelt økning av disse Dual-TCRß + – cellene I v2r31r / V2R31R-mus sammenlignet MED V2R31R/WT-mus at to distinkte v (D)Jß omarrangementer kan bidra Til TCRß uttrykk fra samme allel.

for Å finne ut om en enkelt TCRß allelet kan faktisk støtte uttrykk for TCRß proteiner fra to forskjellige V(D)Jß rearrangements, vi analysert mus der man TCRß allelet er inaktivert ved sletting av TCRß enhancer (Eß) (12, 13). Vi analyserte mus som bar eß-slettet allel overfor EN WT allel, en allel med EN RSS-erstatning av Enten V2 (V2R) eller V31 (V31R), eller begge deler (8). Vi oppdaget en liten prosentandel (0,094%) av v2+ V31 + SP thymocytes i Wt / EβΔ Mus (Fig. 2 a og B), som potensielt representerer en sjelden populasjon av celler som uttrykker to forskjellige tcrß proteiner fra samme WT allel. Uansett observerte Vi v2+ V31 + – celler med en 1,9 ganger større frekvens hos V2r / EβΔ Mus og med en 4,8 ganger større frekvens hos V31r/eβδ Mus (fig. 2 a og B). Ved å forbedre kvaliteten på Enten Vß RSS øker dermed brøkdelen av celler som uttrykker Både v2+ og V31 + tcrß proteiner. Spesielt oppdaget vi en 14,4 ganger økt frekvens Av V2 + V31 + celler I V2rv31r / EβΔ mus i forhold til wt/eβδ Mus (fig. 2 a og B), noe som indikerer at forbedring av kvaliteten på to Vß RSSs øker synergistisk prosentandelen celler som uttrykker Både V2+ og V31+ TCRß proteiner. Faktisk sletter en del Av V31 RSS PÅ V2R allelet (V2R31Δ allelet; Fig. 2c) dramatisk reduserer frekvensen Av v2+V31+ celler til nivåer som er ekvivalente eller mindre enn I V2r/EβΔ Mus (0,178% versus 0,135%; Fig. 2 a og B). Samlet sett bekrefter disse dataene at V2R31R-allelet fremmer uttrykk for to forskjellige tcrß proteiner fra to forskjellige V(D)Jß omarrangementer på et enkelt allel.

vår studie viser at en iboende genetisk mekanisme styrer monogen tcrß montering og uttrykk. Vi viser at Dårlig Kvalitet Vß RSSs samarbeider for å begrense montering og uttrykk for to forskjellige tcrß gener fra ett allel. Vi har tidligere vist at Dårlig Kvalitet Vß RSSs stokastisk begrenser Vß rekombinasjonsfrekvens før tilbakemeldingshemming for å redusere biallelisk montering og uttrykk For tcrß gener (8). Vi konkluderer nå videre med at Lavkvalitets Vß RSSs også reduserer forekomsten av At Både V31 og en oppstrøms Vß rekombinerer på samme allel. Disse rearrangements kunne innebære enten 1) en deletional V2 omorganisering til Dß1–Jß1–Cß1 klyngen og en inversional V31 omorganisering til Dß2–Jß2–Cß2 klynge, eller 2) en inversional V31 omorganisering til Dß1–Jß1–Cß1 klyngen, som inverterer en del av locus som inneholder Dß2–Jß2–Cß2 klynge, og deretter en inversional V2 omorganisering til Dß2–Jß2–Cß2 cluster (7) (Fig. 2D). For å oppnå monogen tcrß montering og uttrykk, KAN DENNE RSS-baserte genetiske mekanismen fungere med epigenetiske prosesser som har blitt involvert for å håndheve monoallelisk vß rekombinasjon. Det har For eksempel blitt foreslått at dynamiske interaksjoner av Vß segmenter med kjernefysiske lamina senker Vß rekombinasjon effektivitet ved repressing Vß chromatin tilgjengelighet og kromosom looping mellom Dß–Jß klynger og oppstrøms Vß segmenter (14, 15). I denne sammenheng, dårlig kvalitet Vß RSSs kan redusere sannsynligheten for at to Vß rearrangements oppstå på et allel når V31 og en oppstrøms Vß segmentet er både tilgjengelig og oppstrøms Vß er repeterende i nærheten med Dß–Jß segmenter. Egenskapene Til RSSs kan således ligge til grunn for monogen montering og ekspresjon av pattedyrsproteiner TCRy, TCRδ og Igλ i pattedyr, Og ig-proteiner i bruskfisk. I tillegg kan V RSSs på samme måte bidra Til Igk og Igλ isotypisk ekskludering i B-celler.