forsøkspersoner, kliniske prøver og HLA genotyping. Alle personer med blodtransfusjonshistorie ble ekskludert fra studien. Trettito familier med en historie med simplex sklerodermi ble rekruttert og studert FOR HLA KLASSE II og klasse i alleler; 3 generasjoner ble studert for 20 familier og 2 generasjoner for 12 familier. Tre generasjoner var nødvendig for studieoppføring for alle kvinner med barn, og deltakelse av alle barn var nødvendig fordi mikrochimerisme kunne stamme fra moren eller fra et barn i disse fagene. Deltakelse av menn, barn og aldri-gravide kvinner inkluderte 2 generasjoner(dvs. emnet og moren). En sklerodermi pasient var en tvilling; upåvirket tvilling ble også rekruttert til studien. Trettitre sunne kontrollfamilier ble rekruttert, inkludert 22 med 3 generasjoner og 11 med 2 generasjoner. HLA genotyping ble fullført for totalt 254 personer: 128 i sklerodermafamilier og 126 i kontroller. Noen ekstra familiemedlemmer ble inkludert for å bekrefte HLA haplotype oppdrag. Fra denne databasen ble forsøkspersonene valgt ut til videre studier da forsøkspersonens mor hadde et ikke-delt hla-allel som var målrettet MOT HLA – spesifikke analyser. Alle fag gitt informert samtykke som godkjent Av Fred Hutchinson Cancer Research Center Institutional Review Board.Pbmcer ble isolert fra hele heparinisert blod ved fortynning i HBSS, etterfulgt av Ficoll-Hypaque (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sverige) gradient sentrifugering ved 1,077 g/mL. FOR noen barn ble DNA ekstrahert fra hårrøttene for hla-typing som beskrevet tidligere (9). Genomisk DNA ble ekstrahert fra PBMCs ved Hjelp Av Et Isoquick Nukleinekstraksjonssett (Orca Research Inc., Bothell, Washington, USA), i henhold til produsentens instruksjoner, og resuspendert i 10 mM Tris-HCl (pH 9,0). DNA mengde og renhet ble bestemt ved standard spektrofotometriske metoder. FOR noen fag ble DNA ekstrahert direkte fra helblodprøver.DNA – basert typing med sekvensspesifikke oligonukleotidprobe paneler ble brukt til å identifisere spesifikke alleler PÅ drb1, DRB3, DRB4, DRB5, DQA1, OG DQB1 loci. FOR DRB1 oppdager en innledende lavoppløsningsanalyse DRB1-familier DBR1 * 01 TIL DRB1*14 og etterfølges av 1 eller flere høyoppløselige analyser som identifiserer spesifikke DRB1-alleler som beskrevet tidligere (10, 11). Dqa1-og DQB1-alleler ble bestemt ved hjelp av metoder som ligner de som er beskrevet tidligere (9), med tilleggsprober lagt til for å oppdage nylig identifiserte alleler (12). Hla klasse i antigener ble bestemt ved hjelp av en standard lymfocytotoksisitetstest som diskriminerer 20 hla-A, 30 HLA-B og 8 HLA-Cw antigener. Noen prøver ble utsatt for sekvensering for å bestemme spesifikke hla klasse i alleler (13). For å bekrefte hla-allel-og antigentildelinger og homozygositet ble flere familiemedlemmer genotypet-inkludert fedre og søsken av fag, når det var tilgjengelig.

HLA-spesifikke PCR-primere. Primersekvenser ble designet basert på alle kjente allelsekvenser (12). Primer syntese ble gjort Av Oligos Etc. (Wilsonville, Oregon, Usa). En primer sett ble utformet for å målrette EN HLA klasse i polymorfisme og 3 målrettet HLA KLASSE II polymorfismer. For å målrette HLA-B44 ble en primer designet som forsterker en gruppe hla-b-alleler basert på polymorfismer i posisjonene 66, 69 og 75 av ekson 3 og en annen gruppe AV hla-B-alleler basert på en polymorfisme i posisjon 229 av ekson 3. Kombinasjonen av primere forsterker spesielt hla-B44 alleler, som produserer et 190-bp-fragment. ALLE DRB-spesifikke primere ble utformet for å forsterke allelgrupper basert på sekvenspolymorfismer i den hypervariable regionen exon 2. FOR HLA-DRB5*01 forsterker en primer en GRUPPE DRB5*01 alleler basert på polymorfismer i posisjonene 25, 26, 31, 32 og 38, og den andre forsterker EN gruppe DRB5*01 alleler basert på polymorfismer mellom posisjonene 215 og 231. Kombinasjonen av primere forsterker spesielt hla-DRB5*01 alleler, som produserer et 210-bp-fragment. FOR HLA-DRB1*04 forsterker en primer en GRUPPE DRB1*04 alleler basert på polymorfismer i posisjonene 25, 26, 31 og 36, og den andre forsterker EN gruppe DRB1*04 alleler basert på polymorfismer i posisjonene 97 og 110. Kombinasjonen av primere forsterker SPESIELT DRB1 * 04, som produserer et 104-bp-fragment. Ytterligere diskriminering BLANT DRB1 * 04-alleler ble oppnådd ved å bruke den tidligere primeren sammen med 1 av 2 primere som diskriminerer en dimorfisme i posisjon 258 (kodon 86), og produserte et 263-bp-fragment. FOR HLA-DRB1*11 forsterker en primer en GRUPPE DRB1 * 11 alleler basert på polymorfier i posisjoner 25, 26, 28, 30, 31, 32, og 35 av exon 2, og den andre primer forsterker en gruppe AV DRB1 * 11 alleler basert på polymorfismer i posisjonene 173 og 174 av exon 2. The combination of primers specifically amplifies DRB1*11 and produces a 178-bp fragment. Primer sequences are as follows: B44-specific primers 5′-TCC GCG GGT ATG ACC AGG A-3′ and 3′-TCC AGG TAT CTG CGG AGC G-5′; DRB5*01-specific primers 5′-TTC TTG CAG CAG GAT AAG TAT-3′ and 3′-GTA GTT GTC CAC CGC GGC G-5′; DRB1*04-specific primers 5′-CCA CGT TTC TTG GAG CAG GTT AAA-3′ and 3′-GCG CAC GTA CTC CTC TTG GTG-5′; DRB1*11-specific primers 5′-CA CGT TTC TTG GAG TAC TCT AC-3′ and 5′-CTG GCT GTT CCA GTA CTC CT-5′.

HLA-specific PCR for maternal microchimerism. PCR–reaksjoner ble utført i et volum på 50 ④l inneholdende 1,25-1,5 µ genomisk DNA, 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8,3), 50 mmol/L KCl, 1,5 mmol MgCl2, 0,001% wt/vol gelatin, 260@mol/L AV hvert deoksynukleotid, 0,5 U Perfect Match PCR Enhancer (Stratagene, La Jolla, California, Usa), 2,5 U AmpliTaq GULL DNA polymerase (perkin-elmer applied biosystems, foster city, california, usa), og 20 PMOL av hver hla-Spesifikk Primer. Ultrarent vann ble tilsatt for å utgjøre det endelige volumet på 50 µ. Forsterkning besto av 5 minutter på 96°C, 35 sykluser på 95°C i 35 sekunder, og ved 65°C i 35 sekunder for HLA-B44 (58.5°C for DRB5*01; 72°C for DRB1*04; 64.5°C for DRB1*11), deretter 72°C i 1 minutt, med en siste utvidelse trinn ved 72°C i 10 minutter. Optimal amplifikasjon, følsomhet og spesifisitet ble oppnådd ved titrering Av MgCl2, og primerkonsentrasjoner, antall termocykler og glødetemperatur. Alle forsterkninger ble utført i Et GeneAmp System 9600 thermocycler (Perkin-Elmer Applied Biosystems). Analyse følsomhet ble bestemt av spiking eksperimenter der målet DNA ble serielt fortynnet og lagt til en fast mengde bakgrunns-DNA som svarer til alleler av emnet. HLA-B44-OG DRB5 * 01-spesifikke PCR-analyser var i stand til å oppdage minst 1 målcelle i en bakgrunn på 500 000 celler; HLA-DRB1*04-og DRB1*11-spesifikke PCR-analyser var i stand til å oppdage minst 1 målcelle i en bakgrunn på 100 000 celler. HVER PCR-analyse inkluderte følgende kontroller: (a) en positiv kontroll AV DNA fra en cellelinje med hla-allelet av interesse (0,2-0,5 µ); (b) positiv kontroll fra forsøkspersonens mor (0,2–0,5 µ); (c) negativ kontroll AV DNA fra en cellelinje med samme hla-alleler som forsøkspersonen (1,25 µ og 0,35@g); og (d) negativ kontroll av ALLE PCR-reagenser uten DNA. PCR-produkter ble elektroforesert ved 100 V konstant spenning i 1 time i 6% eller 8% prefabrikerte tbe-geler ved Bruk Av En Novex Xcell II Mini-Celle (Novex, San Diego, California, USA). Hver gel inkluderte positive OG negative PCR-kontroller og en 100-bp stige (SLL-100; Gensura, Del Mar, California, USA). Gels ble farget med sølv flekk (Silver Stain Plus Kit, Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, California, USA) og tørket Med DryEase Gel Tørkesystem (Novex). DNA ekstrahert fra fullblod ble testet i 4 prøver med utilstrekkelig mengde for å isolere Pbmcer. Alle tester ble gjort i to eksemplarer, og de fleste prøver ble analysert mer enn en gang.

PCR forholdsregler. Ekstrem forsiktighet ble brukt for å unngå OG oppdage MULIG PCR-forurensning. Separate områder ble brukt FOR pbmc separasjon, utvinning av genomisk DNA, PCR oppsett OG forsterkning, og analyse AV PCR produkter, med FØR-OG-ETTER PCR tester utført i separate laboratorier. Aerosolresistente pipettespisser (Molecular Bio-Products Inc.(San Diego, California, USA) ble brukt i alle eksperimenter, og flere negative kontroller ble inkludert i ALLE PCR-forsterkninger.

Sekvensering AV HLA-spesifikke PCR-produkter. Syv mikroliter av det opprinnelige HLA-spesifikke PCR-produktet ble utsatt for ytterligere 40 sykluser med forsterkning ved hjelp av de opprinnelige termocyclingparametrene. Tretti mikroliter AV DETTE PCR-produktet ble elektroforisert i en 1,75% ultrapure agarosegel (GIBCO BRL, Grand Island, New York, USA) og farget med en oppløsning av etidiumbromid (0,5 µ/mL). Bandet ble skåret ut, eluert og renset ved Hjelp Av Et Qiaquick Gel Extraction Kit (QIAGEN Inc., Valencia, california, USA). Det rensede PCR-produktet ble eluert til 30 µ Av 10 mmol Tris-HCl (pH 9,0), og 100 ng ble tilsatt til en reaksjonsblanding inneholdende 8,0 µ av sekvenseringsreagensforblanding (Termosekvenase; Amersham Corp., Arlington Heights, Illinois, USA), 12. 5 pmol 5′ eller 3′ primer, samt 1 µ DMSO (Sigma Chemical Co.( St. Louis, Missouri, USA). Ultrarent vann ble tilsatt for å gi et endelig volum på 20 µ. Sekvenseringsreaksjonsblandingene ble oppvarmet til 96 hryvnias C i 3 minutter i Et GeneAmp-System 9600 thermocycler, etterfulgt av 25 sykluser ved 96 hryvnias C i 10 sekunder, 50°C i 5 sekunder og 60 hryvnias C i 4 minutter. Resulterende PCR-produkter ble kolonne renset og elektroforesed som ovenfor. Sense-og antisense-sekvenser ble bestemt i to eksemplarer for fagets OG mors HLA-spesifikke PCR-produkter, samt for positive kontrollcellelinjer PCR-produkter. Sekvensanalyse ble utført Med Wisconsin Pakke versjon 9.1 programvare Fra Genetics Computer Group (Madison, Wisconsin, USA).

Cytospin slide forberedelse og in situ hybridisering. Cytospin slide-preparater ble analysert for Tilstedeværelse Av X – og Y-kromosomspesifikke sekvenser, ved hjelp Av en teknikk utviklet I Fred Hutchinson Cancer Research Center Molecular Cytogenetics Laboratory for kvantitativ analyse av chimerisme i sex-feilaktige stamcelletransplantasjonspar (14). Cytospinprøver av hannceller ble fremstilt ved sentrifugering av 30 000-60 000 nyskilte Pbmcer på glassglass, 300 µ per lysbilde. Lysbilder ble lagret i et tørkekammer til bruk. Den x-kromosomspesifikke sonden DXZ1 (15) ble nick-oversatt med digoxigenin, Og DEN Y–kromosomspesifikke sonden DYZ1 (16) ble nick-oversatt med biotin. Xy-sondeblandingen hadde en endelig konsentrasjon på 0,5 µ / mL av hver sonde i hybridiseringsbuffer på 50% formamid, 2× SSC (0,3 m natriumklorid og 0,03 m natriumsitrat) og 10% dekstransulfat. Den ble denaturert ved 72°C i 5 minutter, avkjølt på is og påført lysbildet. Lysbilder ble fordøyd i pepsin (0,1 mg / mL i 0.01 M HCl) ved 37°C i 3 minutter, fast i 4% bufret formalin i 15 minutter, skylt I PBS, dehydrert i etanol (70%, 95% Og 100%), og lufttørket. Lysbildene ble denaturert ved behandling i 2× SSC (72°C) i 10 minutter, 70% formamid, 2× SSC (72°C) i 3 minutter, dehydrert i en etanolserie (-20°C) og lufttørket. Ti mikroliter sonde ble påført lysbildet og deretter montert under en dekkglass (22 × 22 mm) forseglet med gummisement. Den ble inkubert over natten ved 42°C i et fuktet kammer. Lysbildene ble vasket i 55% formamid, 2× SSC (45°C) i 15 minutter og 2× SSC (romtemperatur) i 5 minutter. Sondesignaler ble samtidig detektert med fluoresceinkoblet anti-digoksigenin (1:500 fortynning; Boehringer Mannheim Biokjemikalier, Indianapolis, Indiana, USA) Og Texas rødkoblet avidin (1:500 fortynning; Vector Laboratories, Burlingame, California, USA) i 30 minutter ved romtemperatur i mørket. Etter vask med 2× SSC og PBS ble de montert MED VECTASHIELD (Vector Laboratories). Lysbilder ble evaluert direkte ved Hjelp Av Et Nikon E600 epifluorescensmikroskop med en 100-W kvikksølvlampe utstyrt med passende enkelt -, dobbelt-og trippelbåndpassfiltre. Bare celler med 2 synlige kromosomsignaler ble oppregnet, uten å bruke noen elektronisk forbedring.