Morfologi Av Myoepitelialcellen: Immunhistokjemisk Karakterisering fra Hvile Til Motil Fase
Abstract
Myoepitel er tilstede i canine mammary tumorer som hvilende og proliferative suprabasal og spindel og stellate interstitielle celler. Målet med dette papiret var å evaluere et panel av markører for identifisering av fire forskjellige myoepithelial celle morfologiske typer i normal og neoplastisk brystkjertel og for å undersøke immunhistokjemiske endringer fra en epitel til en mesenkymal fenotype. Cytokeratin 19 (CK19), cytokeratin 5/6 (CK5/6), cytokeratin 14 (CK14), østrogenreseptor (ER), p63 protein, vimentin (VIM) og α-glattmuskelaktin (Alfa-SMA) antistoffer ble brukt på 29 neoplasmer (3 godartede og 3 maligne myoepiteliale svulster, 7 karsinomer i godartede blandede svulster og 16 komplekse karsinomer) og på normalt vev i brystkjertlene. Alle disse antistoffene ble også testet på 3 brystvev fra dyr uten brystpatologi. De myoepiteliale markørene ble godt uttrykt i suprabasale celler og gradvis tapt i motile typer, med stellatcellene som bare opprettholder VIM-uttrykk som er typisk for mesenkyma. ER merket noen hvilende og motile myoepiteliale celler. På grunnlag av våre resultater foreslår vi en overgang fra myoepiteliale immotile celler til migrerende fibroblastlignende celler. Denne overgangen og karakteriseringen av et immunhistokjemisk panel for hvilende og motile myoepiteliale celler kaster mer lys på den biologiske oppførselen til myoepiteliale celler.
1. Innledning
Svulster I Melkekjertlene hos hunder er dannet av både epitel (epitel og myoepitel) og mesenkymale komponenter. Opprinnelsen til mesenkymceller er fortsatt diskutert. Den forhøyede frekvensen av svulster som viser myoepitelial eller basalcelleproliferasjon er et unikt trekk ved hundens brysttumorer .
i den normale brystkjertelen blir lumina avgrenset av et indre lag av polariserte epitelceller som hviler på to ytre eller basale lag av epitel-og myoepitelceller . Både basale og myoepiteliale celler syntetiserer basalmembranen i kanaler og alveoler og danner en strukturell barriere mellom luminale epitelceller og den omkringliggende stroma . I kanaler danner myoepitelceller et nesten kontinuerlig lag av celler orientert parallelt med kanalens lange akse. Dette laget omgir luminal epitelceller og skiller dem fra basalmembranen og stroma. I alveolene er myoepiteliale celler diskontinuerlige, og danner et kurvlignende nettverk rundt alveolene, slik at noen luminale epitelceller kan kontakte kjellermembranen direkte . Derfor er myoepitelet ikke bare plassert i en ideell posisjon for å kommunisere mellom disse to rommene, men det er også posisjonert for å gi viktige regulatoriske signaler for vedlikehold av normal cellestruktur .
basert på immunhistokjemi, viser de tre lagene av celler i den normale brystkjertelen forskjellige markører: luminalepitelet er merket MED CK19, og basalcellene og myoepitelceller er farget AV CK5 / 6 OG CK14 og p63, Alpha-SMA og VIM . Myoepitelceller er kontraktile elementer som viser en kombinert epitel-og glattmuskelimmunoprofil. Markørene nevnt ovenfor er uttrykt i cytoplasma, bortsett fra p63 som er en nukleær markør . Myoepitelcellelaget er den eneste kilden til tumorsuppressor p63, som er signifikant hemmet på proliferasjon og invasjon av tilknyttede tumorceller . I tillegg er basale myoepitelceller i normal brystkjertel av og til merket MED ER-antistoff, som brukes til molekylærbasert klassifisering av hundemammetumorer .Distinkte myoepiteliale cellemorfologier kan gjenkjennes i canine komplekse og blandede svulster: hvilende og proliferative suprabasale myoepiteliale celler og spindel og stel motile interstitielle myoepiteliale celler. Suprabasale celler ligger mellom basalmembranen og luminalepitelet og utviser flatt spindel (hvilende celler) eller polygonale morfologier (proliferative celler). Interstitielle celler er ofte arrangert i faste reir apposed til epitelelementer eller isolert i interstitium . Spindel og stellat myoepithelialceller skiller seg mot en mer generell kontraktil fenotype .Interstitielle myoepiteliale celler kan etter hvert bli fibroblastlignende celler, som bare viser VIM immunoreaktivitet . Myoepitelial differensiering kan kulminere i dannelsen av forskjellige mesenkymale vev, inkludert brusk og bein i canine mammary blandet tumor.oppkjøpet av typiske trekk ved mesenkymceller vil sannsynligvis oppstå gjennom epitel-mesenkymal overgang (EMT). EMT ER et biologisk fenomen som gjør det mulig for en polarisert epitelcelle, som normalt interagerer med kjellermembranen via sin basale overflate, å gjennomgå flere biokjemiske endringer som gjør det mulig å anta egenskapene og funksjonene til mesenkymale celler .denne artikkelen vil fokusere på ulike aspekter av myoepitelceller og brysttumorer hos hunder, spesielt (1) karakterisering av de fire forskjellige myoepiteliale cellemorfologiske typene i normal og neoplastisk brystkjertel ved hjelp av et panel av antistoffer og (2) de immunhistokjemiske endringene i myoepiteliale celler fra en epitel til en mesenkymal fenotype.
2. Materialer og Metoder
2.1. Prøver
Brystkjertelprøver av 29 hunder ble hentet fra databasen Til Anatomopatologisk Tjeneste Ved Veterinærmedisinsk Fakultet I Bologna. Fagene tilhørte forskjellige raser: kjøter (𝑛=13), tysk shepherd (𝑛=3), Puddel (𝑛=3), Yorkshire Terrier (𝑛=3), Dachs (𝑛=2), Setter (𝑛=1), Peker (𝑛=1), Cocker spaniel (𝑛=1), Schnauzer (𝑛=1), og Siberian Husky (𝑛=1); de var alle kvinner, med en gjennomsnittlig alder på 9.20±2.28 år (gjennomsnitt ± SD). Svulstene besto av: 3 godartede myoepiteliale svulster, 3 maligne myoepiteliale svulster, 7 karsinomer i godartede blandede svulster og 16 komplekse karsinomer (de to siste gruppene ble differensiert ved tilstedeværelse av brusk og / eller ben i de blandede svulstene). I tillegg ble 29 prøver fra normale brystkjertler av samme tumorlinje og 3 brystprøver fra 3 friske, ikke-mammære svulstbærende hunder evaluert.
Svulster ble klassifisert i Henhold Til Misdorp et al. Og Goldschmidt et al. i godartede myoepiteliale svulster: en sjelden neoplasma bestående av myoepiteliale celler arrangert i korte bunter blandet med et ekstracellulært fibrillært basofilt materiale; ondartede myoepiteliale svulster: forskjellig fra den godartede varianten med flere polymorfe myoepiteliale celler; komplekst karsinom: et karsinom bestående av både luminale epitel-og myoepiteliale komponenter; karsinom i godartet svulst: en svulst med foci av maligne epitelceller eller forskjellige knuter av slike celler som forekommer sammen med mesenkymale celler som har produsert brusk og / eller bein muligens i kombinasjon med fibrøst vev.
2.2. Immunhistokjemi
Fire µ tykke seksjoner ble kuttet fra formalinfaste parafininnbygde blokker som inneholdt representative tumorprøver. Immunhistokjemi for følgende markører ble gjort på disse vevene: CK19, ER, CK5 / 6, CK14, VIM, Alfa-SMA, p63.
Seksjonene ble dewaxed i toluen og rehydrert. Endogen peroksidase ble blokkert ved nedsenkning i 0,3% hydrogenperoksid i 20 min. Seksjoner ble deretter skyllet I Tris buffer. Antigeninnhenting ble utført med citratbuffer (2,1 g sitronsyremonohydrat/liter destillert vann), pH 6,0 (unntatt CK5/6 og ER, som brukte EDTA, pH 8,0) og oppvarming i to 5 min perioder i en mikrobølgeovn ved 750 W, etterfulgt av avkjøling ved romtemperatur i 20 min. De primære antistoffene er oppsummert i Tabell 1. Alle primære antistoffer ble inkubert over natten ved 4°C, etterfulgt av en kommersiell streptavidin-biotin-peroxidase teknikk (LSAB Kit, Dako, Amsterdam, Nederland). Diaminobenzidin (0,05% i 10 minutter ved romtemperatur) ble brukt som kromogen. Lysbilder ble counterstained Med Papanicolaou ‘ s hematoxylin.
Tabell 1
immunhistokjemi.
som en negativ kontroll ble det primære antistoffet erstattet med et irrelevant, isotype-tilpasset antistoff for kontroll for ikke-spesifikk binding av det sekundære antistoffet. Positive vevskontroller med de samme IHC-protokollene inkluderte normal brystkjertel hos hund (anti-CK19, – ER, – CK14,-VIM, Alfa-SMA, – p63 antistoffer) og hud hos hund (anti-CK5/6). antall positive celler ved hver markør ble beregnet semikvantitativt: – = ingen fargede celler, ± = mindre enn 5% positive celler, + = 5-50% positive celler, ++ = mer enn 50% positive celler. Tilfeller ble ansett som positive for ER når kjernefarging ble observert i minst 5% tumorceller . 3. ResultaterFire typer myoepiteliale celler ble anerkjent på grunnlag av deres morfologi. Den hvilende subtypen viste de langstrakte egenskapene til spindelceller i nær kontakt med luminale epitelceller, samt prolifererende suprabasale celler som i stedet viste en polygonal form (Figur 1(a)). De interstitiale motile cellene ble observert både danner reir (spindeltype foret reir og stellate cellene utgjorde reiret kjernen) og isolert i interstitium (Figur 2(a)).  (a)  (b)  (c)  (d)  (e)  (f)  (g)  (h) (a) (b) (c) (d) (e) (f) (g) (h) (h) figur 1 suprabasal myoepithelial celler: hvile (tynne piler) og proliferative (tykke piler) celler. Immunhistokjemisk uttrykk av et panel av antistoffer påført AV IHC, 63x (a) Hematoksylin-eosin; (b) anti-CK19 antistoffer merking cytoplasma; (c) anti – er antistoffer merking kjernene; (d) anti-ck 5/6 antistoffer merking cytoplasma; (e) anti-CK14 antistoffer merking cytoplasma; (f) anti-VIM antistoffer merking cytoplasma; (g) Anti-Alfa-SMA antistoffer merking cytoplasmisk membran; (h) anti-p63 antistoffer merking kjerner.  (a)  (b)  (c)  (d)  (e)  (f)  (g)  (h) (a) (b) (c) (d) (e) (f) (g) (h) Figure 2
Motile myoepithelial cells: spindle (asterisks) and stellate (stars) cells. Immunohistochemical expression of a panel of antibodies applied by IHC. 63x (a) Hematoxylin-eosin; (b) anti-CK19 antibodies labeling the cytoplasm; (c) anti-ER antibodies labeling the nuclei; (d) anti-CK 5/6 antibodies labeling the cytoplasm; (e) anti-CK14 antibodies labeling the cytoplasm; (f) anti-VIM antistoffer merking cytoplasma; (g) Anti-Alfa-SMA antistoffer merking cytoplasmisk membran; (h) anti-p63 antistoffer merking kjerner. 3.1. Normal Brystkjerteli de 3 kontrolltilfellene ble alle hvilende og proliferative suprabasale myoepiteliale celler merket av p63, CK14, Alpha-SMA og VIM. Hvilende og proliferative suprabasale myoepiteliale celler uttrykte IKKE CK19 i noen av tilfellene. 3.2. Brystvev fra Samme Linje Av Brysttumoreni de 29 normale vevene i samme linje som svulstene ble alle hvilende og proliferative suprabasale myoepiteliale celler merket av p63, CK14, Alpha-SMA og VIM. CK5 / 6 var positiv i alle unntatt fire tilfeller og ER ble påvist i 12 tilfeller. CK19-ekspresjon ble bare observert i luminalepitelet. Myoepiteliale motile interstitielle celler ble ikke observert. Alle resultatene er oppsummert I Tabell 2.
Tabell 2
Immunhistokjemiske resultater for suprabasale og motile myoepiteliale celler.
3.3. BrysttumorerImmunhistokjemiske resultater for suprabasal (Figur 1) og motile celler (Figur 2) ved bruk av p63, CK14, CK5/6, CK19, Alfa-SMA, VIM og ER er oppsummert i Tabell 2. CK5 / 6 merket: suprabasale hvileceller i 16 av de 29 tilfellene(5 karsinomer i godartede blandede svulster og 11 komplekse karsinomer). CK 5/6 også merket proliferative suprabasal og spindel motile celler i 10 tilfeller (3 karsinomer i godartede blandede svulster og 7 komplekse karsinomer). Stellatmotile celler var tilstede i 25 tilfeller (1 godartet myoepitelial tumor, 3 maligne myoepitelial svulster, 5 karsinomer i godartede blandede svulster og 15 komplekse karsinomer), men var negative FOR CK5/6. Brusk i brystblandede svulster var alltid negativ. CK14 viste positivitet i 23 tilfeller i hvileceller (med unntak av 1 komplekst karsinom og godartede og ondartede myoepiteliale svulster), i 22 tilfeller i proliferative celler (6 karsinomer i godartede blandede svulster og 15 komplekse karsinomer) med en tendens til å miste uttrykket når disse cellene hadde fått den mer motile fenotypen av spindelceller (positiv i 2 godartede og 3 ondartede myoepiteliale svulster, 2 karsinomer i godartede blandede svulster og 2 komplekse karsinomer). Kondrocytter av blandede svulster var negative. VIM var positiv i suprabasale celler i de 23 tilfellene av karsinom i godartet tumor og kompleks karsinom og i motile myoepiteliale celler i alle 29 tilfeller. Stromalceller var positive i alle tilfeller. Brusk var VIM positiv i alle 7 karsinomer i godartede blandede svulster.Alfa-SMA-merkede hvilende og proliferative suprabasale myoepiteliale celler i 23 karsinomer i godartede blandede svulster og komplekse karsinomer. Spindelcellene i 10 tilfeller (5 karsinomer i godartet blandet tumor og 5 komplekse karsinomer) viste positivitet for Alfa-SMA. I hvert tilfelle, bortsett fra to komplekse karsinomer, var stellatceller negative. Stroma viste positivitet i bare 6 tilfeller(1 karsinom i godartet blandet tumor og 5 komplekse karsinomer). P63 ble påvist i hvilende og proliferative suprabasale myoepiteliale celler i de 23 tilfellene av karsinom i godartet-blandet tumor og komplekst karsinom. Alle spindel-og stellatmotile celler var negative. Stromalceller og brusk var negative. ER-ekspresjon var tilstede i 11 suprabasale myoepiteliale celler (4 karsinomer i godartede blandede svulster og 7 komplekse karsinomer); spindel-og stellatmotile celler var positive i 9 tilfeller(3 karsinomer i godartede blandede svulster og 6 komplekse karsinomer). Brusk av blandede svulster var negativ.Hvilende og proliferative suprabasale og spindel/stellate motile myoepiteliale celler uttrykte IKKE CK19 i noen av de undersøkte svulstene. Brusk av blandede svulster var også negativ FOR CK19. 4. DiskusjonBasert På funnene Fra Gama et al. Og Tateyama et al. er fire morfologiske typer myoepiteliale celler tilstede i brystkjertelen: hvilende og proliferative suprabasale myoepiteliale celler foring alveoler og kanaler og spindel og stel interstitielle motile celler, som ligger i det interstitielle rom hvor de kan være anordnet i reir. Myoepiteliale markører, som p63, CK5/6, CK14, Alfa-SMA og VIM, viste seg å være verdifulle diagnostiske tillegg for å lette evalueringen av komplekse og blandede proliferasjoner. CK19 regnes som gullstandardmarkøren for luminal epitel og ble brukt til å unngå feildiagnose med myoepiteliale celler. På grunn av kryssreaktivitetsmønstre og det faktum at lesional foci vanligvis er små, likte ingen av de myoepiteliale markørene 100% følsomhet og spesifisitet for myoepiteliale celler. Som sådan bør minst 2 markører brukes til å evaluere et gitt fokus .basert på våre resultater var den beste markøren for suprabasale celler p63, spesielt i forbindelse MED CK14, som var begrenset til modne (basale) myoepiteliale celler og i mindre grad etterfulgt AV CK5 / 6, Alfa-SMA og VIM (Figur 1). CK5 / 6 markerte imidlertid også luminale epitelceller som gjør det vanskelig å skille dem fra proliferative suprabasale myoepiteliale celler . Morfologisk kan både epitel-og myoepitelceller ha en polygonal form. Karakteristisk FOR BÅDE CK14 OG CK5 / 6, men ikke for p63, Alfa-SMA og VIM, var deres reduserte ekspresjon i myoepiteliale celler i suprabasal proliferativ tilstand. Ck14, CK5/6, og p63 uttrykk ble gradvis tapt i celler i spindel og stellate motile tilstand. Alfa-SMA og VIM var tilstede i spindelmotile myoepiteliale celler med forskjellige intensitetsnivåer. Bare VIM viste seg å være en konsekvent markør for stellate motile myoepithelialceller. I denne studien ble stellate motile myoepithelium arrangert i reir og foret av hvilende celler antagelig av alveolær opprinnelse. Denne funksjonen kan støtte ideen om at reir av stellate motile myoepiteliale celler, som har mistet uttrykk for de viktigste myoepiteliale suprabasale markører, men beholdt affinitet FOR VIM, er forløperne av brusk, noe som indikerer at disse cellene har fullført sin transformasjon i mesenkymale elementer. I godartede og ondartede myoepiteliale svulster var vim-merking i alle tilfeller tap av alle andre suprabasale myoepiteliale markører og den svake positiviteten TIL CK14 i spindelceller indikativ for et rådende uttrykk for myoepitelmotiltilstanden og en mulig passasje fra enkle myoepiteliale celler til mesenkymale fibroblaster.i vår studie ble bevis på at myoepiteliale celler skiftet til en mesenkymal fenotype, vist ved tap AV CK14, CK5 / 6 og p63-uttrykk, forsterket av diskontinuerlig merking av spindelceller For Alfa-SMA, en markør for både myoepiteliale celler og myofibroblaster, som var helt tapt i stellatmotile celler som angivelig har blitt fibroblaster. Ytterligere bekreftelsesstudier Av Tsuda et al. rapportert forekomsten av myofibroblaster med rester AV CK14-uttrykk (beskrevet som «konverterte myoepiteliale celler»). I de tilfellene som ble undersøkt i denne studien, ble CK14 gradvis falmet, og indikerte derfor tap av (myo-)epitelfenotypen. Disse resultatene støtter EMT-hypotesen som involverer en myoepitelial-lignende tilstand, som gjennomgår en myoepitelial mesenkymal overgang (MMT). Denne hypotesen ble bekreftet hos hunden Av Gä et al. who uttalte at i brysttumorer innebærer et av trinnene i utviklingen av mesenkymale celler uttrykk for typiske myoepiteliale egenskaper.Et interessant resultat av denne studien var positiviteten til ER funnet i 12/29 suprabasale myoepiteliale celler og 9/29 stellatceller av karsinom i godartede blandede svulster og komplekse karsinomer. To isoformer AV er-reseptorer er beskrevet, nemlig ER-α og er-β, sistnevnte er den eneste formen uttrykt i kjernene til isolerte basal-myoepiteliale celler . Antistoffet som ble brukt i den foreliggende undersøkelsen omfattet begge isoformene: både luminale og basale/stellatceller ble merket, antagelig luminale celler av er-α og basale/stellatceller av er-β. til slutt ble de suprabasale myoepiteliale cellene godt preget av p63 og CK14 og i mindre grad av den andre markøren som ble brukt. De motile myoepiteliale cellene er i stedet preget Av Alfa-SMA og VIM og tap AV CK14, CK5 / 6 og p63 (Figur 2). Den foreliggende studien viste OGSÅ ER i både luminale epitel-og suprabasale/stellate myoepiteliale celler (sistnevnte i omtrent halvparten av tilfellene) og at ER-uttrykket ikke påvirkes av hvilende/motile fasen. I serielle eller flerfargede seksjoner kan immunhistokjemi til ER i kombinasjon med p63 og CK14 derfor bidra til å unngå feilaktig identifisering av luminale eller myoepiteliale celler i hundemammetumorer. Trenden med bevart Alfa-SMA og VIM-uttrykk i spindelceller, og bare vim-positivitet i stellatmotile celler, samt det reduserte p63-uttrykket i begge motile typer, støtter hypotesen OM EMT som involverer en myoepitheliallignende tilstand I MMT. Spindelmotile cellen kan betraktes som en tidligere transformasjon enn stellatcellen mot en mesenkymal fenotype. Forfatterbidragdisse forfatterne bidro like mye til dette arbeidet. Interessekonfliktforfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende interesser. Bekreftelseforfatterne takker Anne Collins For redigering av den engelske teksten. Supplerende MaterialerSupplerende Tabell 1: Immunhistokjemiske resultater. Supplerende Tabell 2: Alder, Rase og Kliniske Funn.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||