Rolle Neisseria meningitidis PorA Og PorB Uttrykk I Antimikrobiell Følsomhet | Company Pride
BREV
Neisseria meningitidis kan forårsake potensielt dødelig systemisk sykdom. Tidlig diagnose og rask antimikrobiell intervensjon er avgjørende for gunstige kliniske resultater. Antibiotikaresistens er rapportert for penicilliner (1), tetracyklin (2) og sulfonamider (3), samt kinoloner (4) og rifampicin (5).
N. meningitidis uttrykker to hovedporiner, PorA og PorB, som er antigenvariable mellom stammer og innenfor en stamme, Og PorA er fasevariabel (tilfeldig på/av-bryter) (6). Neisseria gonorrhoeae uttrykker en enkelt porin, PorB. Endringer i porinuttrykk eller variant poriner medierer antibiotikaresistens i Flere Gram-negative bakterier, inkludert N. gonorrhoeae (7, -10). I n. meningitidis øker fraværet Av PorB motstanden mot tetracyklin og cefsulodin in vitro (11). Poras rolle i antimikrobiell resistens er ikke rapportert for meningokokker. I tillegg til den foreslåtte rollen i immununndragelse, antydet vi at fasevariabel PorA-uttrykk kan gi en åpenbar mekanisme for meningokokker å unngå antimikrobielle midler hvis PorA medierer antibiotikaopptak eller utelukkelse. Vi genererte stammer som manglet PorA eller PorB og gjennomførte MIC-analyser. Vi testet også om endret PorA-uttrykk er valgt ved antimikrobiell eksponering i LØPET av MIC-analysen.porA-og porB-genene med flankerende sekvenser ble forsterket FRA n. meningitidis-stammen MC58 og klonet til pGEM t-easy. Inverse PCR etterfulgt av selvligering ga plasmider med interne slettinger og introduserte begrensningssteder. LacZ / kanamycin-kassetten (12) ble klonet inn i det introduserte SmaI-stedet for det slettede PorA-allelet, noe som ga plasmid pPorALacZKan. Et kloramfenikol acetyltransferase-gen ble forsterket og klonet i det introduserte bglii-stedet for det slettede porB-allelet, i plasmid pPorB:CAT. Pora lacZ kan eller porB::cat-konstruksjonene ble forvandlet til n. meningitidis stamme ¢9 (13) for å gi stammer ¢9δ og ¢9δ Allelisk erstatning av villtype porA-eller porB-alleler med mutantallelet ble bekreftet VED PCR og sekvensering, samt SDS-SIDE Av Sarkosyl-ekstraherte ytre membranproteiner (Fig. 1A).
Analyse av porinuttrykk under MIC-analyse. (A) Membranproteiner ble isolert ved Sarkosylekstraksjon, og 10 µ ble separert på 8 til 12% bis-Tris akrylamidgeler før Coomassie-farging. Kjørefelt 1, ¢9; kjørefelt 2, ¢9 hryvpora; kjørefelt 3, ¢9 hryvporb. (B) Prøver fra den siste brønnen som viste turbiditet ble belagt PÅ BHI agar og immunoblottet med Den PorA-spesifikke MAB MN14C11. 6.
MIC ble vurdert ved buljongmikrodilusjonsmetode i 96 brønnplater (14) ved bruk av bakterier dyrket over natten på supplert bhi agar ved 37°c og subkulturell risting i ca. 4 timer I BHI buljong ved 37°C før justering til ca. 5 × 105 CFU / ml basert på optisk tetthet ved 600 nm (OD600). Etter tilsetning av 50 µ til serielt fortynnede antibiotika ble MICs registrert etter nattlig vekst ved 37°C (Tabell 1) da konsentrasjonene der det ikke ble observert turbiditet. Hver analyse ble gjort tre ganger, hver gang i tre eksemplarer. For hver behandling var MICs identiske i og mellom analysene.
TABELL 1
Mikrofoner for villtype Og mutant N. meningitidis strainsa
| Antibiotikum | MIC (µg/ml) | |||
|---|---|---|---|---|
| ¢9 | ¢9ΔPorA | ¢9ΔPorB | ||
| Cefotaksim | 0.003125 | 0.003125 | 0.00625 | |
| Ceftazidim | 0.03125 | 0.03125 | 0.0625 | |
| Cephalothin | 0.3125 | 0.3125 | 0.625 | |
| ampicillin | 0.0625 | 0.0625 | 0.0625 | |
| Carbenicillin | 0.0625 | |||
| cloxacillin | 1.25 | 1.25 | ||
| penicillin g | 0.03125 | 0.03125 | 0.03125 | |
| Piperacillin | 0.03125 | 0.015625 | ||
| Tetracyklin | 0.3125 | 0.625 | 0.3125 | 0.625 |
| doksycyklin | 0.1875 | 0.1875 | 0.375 | |
| Ciprofloxacin | 0.003125 | 0.003125 | 0.00625 | |
| nalidixinsyre | 1.25 | |||
| imipenem | 0.0625 | 0.0625 | 0.0625 | |
| Rifampin | 0.125 | |||
Våre resultater bekreftet at tap av meningokokk PorB-uttrykk øker motstanden mot tetracyklin (11). Mutasjoner i PorB bidrar også til resistens mot tetracyklin I N. gonorrhoeae (9, 15). Anbefalt kombinasjonsbehandling for multipliser resistent n. gonorrhoeae inkluderer injiserbar ceftriaxon og oral doksycyklin eller azitromycin (16). I denne sammenheng er det påfallende at meningokokk ¢9δ mutantstammen hadde redusert følsomhet overfor doksycyklin. Vi merket redusert følsomhet for cefalotin for ¢9δ og også for cefalosporiner cefotaksim og ceftazidim. En tidligere rapport knyttet N. meningitidis PorB-mutasjon med økt cefsulodinresistens (11). I N. gonorrhoeae, PorB loop 3 varianter bidrar også til økt cefalosporinresistens (17). Vår bekreftelse på At Neisseria PorB modulerer cefalosporinfølsomhet øker muligheten for at reduksjon i følsomhet for denne klassen kan oppstå klinisk eller lettes av mutasjoner I PorB i enten meningokokker eller gonokokker.Bruk Av Fluorokinolon anbefales ikke lenger ved gonokokkinfeksjon (18), og punktmutasjoner I PorB1b av n. gonorrhoeae bidrar til redusert følsomhet For n. gonorrhoeae overfor ciprofloksacin. Ekspresjonsendringer i gonokokkporin endrer ciprofloksacinresistens (19); vi fant at mutasjon av meningokokk PorB også resulterer i redusert ciprofloksacinfølsomhet. Omvendt var denne stammen mer utsatt for rifampicin, det andre store valget for meningokokkprofylakse, kanskje gjennom endret membranarkitektur, som det har blitt foreslått for endret rifamycinresistens av kolistinresistent Acinetobacter baumannii (20).
i motsetning til Dette observerte vi ingen endringer i følsomhet for ¢9 hryvnias sammenlignet Med pora+ moderstammen for noen av de testede antibiotika (Tabell 1). Dette antyder at Enten PorA ikke har noen direkte rolle i innføringen av antimikrobielle midler i cellen, eller at det er seleksjon for redusert PorA-ekspresjon via fasevariasjon under MIC-analysen, enten i foreldrestammen eller i ¢9ΔPorB, som potensielt maskerer PorA-mediert antibiotikainngang. For å vurdere dette isolerte vi bakterier fra den endelige brønnen der turbiditet ble observert og vurdert PorA-ekspresjon ved koloniimmunoblotting ved bruk av anti-P1. 7 murint monoklonalt antistoff (MAB) MN14C11. 6 (hentet fra NIBSC, Storbritannia). Som kontroller ble reaktiviteten sammenlignet mellom foreldrestammen ¢9 og pora mutantstammen ¢9δ. Dette viste At PorA-uttrykket var uendret mellom kontrollbrønner og etter eksponering for noen av de testede antimikrobielle stoffene (Se Fig. 1B); dermed er redusert følsomhet for ¢9δ ikke på grunn av endrede PorA-uttrykksnivåer.
våre resultater er i samsvar med tidligere rapporter om En rolle For n. meningitidis PorB i cefalosporiner og tetracyklinresistens (9, 11, 15). Parallellene med gonokokk PorB1b med hensyn til antibiotikaresistens er slående. Å slå Ut PorB-uttrykk reduserte også meningokokkens følsomhet for doxycyklin, en av de anbefalte terapiene for multipliser resistent n. gonorrhoeae. Dette tyder på at selektivt trykk kan føre til utvikling av gonokokkporb-varianter med redusert følsomhet for doksycyklin. Selv om vi bare registrerte 2-ganger forskjeller som isolert sett ikke vil føre til behandlingsfeil, har synergien Av PorB-variasjon med andre mutasjoner potensial til å utvide meningokokk-og gonokokkresistensspekteret. Vi fant ingen bevis for En rolle For PorA i antimikrobiell transitt over ytre membran.